Репарация генетическая - процесс устранения генетических повреждений и восстановления наследственного аппарата, протекающий в клетках живых организмов под действием специальных ферментов. Способность клеток к репарации генетических повреждений впервые была обнаружена в 1949 году американским генетиком А.Кельнером. В дальнейшем были исследованы многообразные механизмы удаления поврежденных участков наследственного материала, обнаружено, что реперация генетическая присуща всем живым организмам. По-видимому, способность к репарации генетической повреждений появилась на ранних этапах развития жизни на Земле и совершенствовалась по мере эволюции живых существ: ферменты репарации имеются у древнейших представителей растительного и животного мира. К настоящему времени обнаружено большое количество специализированных репарирующих ферментов, а также гены (см. Ген), контролирующие их синтез в клетках. Доказано, что изменения в этих генах повышают чувствительность организма к неблагоприятным и повреждающим факторам, способствуют возрастанию наследственных изменений - мутаций (см. Мутагенез), возникновению болезней и преждевременному старению. Установлено, что некоторые наследственные болезни человека развиваются в связи с нарушениями синтеза репарирующих ферментов. Детально изучены две формы репапрации генетической - фотореактивация и темновая репарация.
Фотореактивация , или световое восстановление, была обнаружена в 1949 г. А. Кельнер, изучая биологическое действие радиации в экспериментах на микроскопичских грибах и бактериях, обнаружил, что клетки, подвергшиеся одинаковой дозе ультрафиолетового облучения, выживают значительно лучше, если после облучения в темноте их поместить в условия обычного естественного освещения. Исходя из этого, было высказано предположение, что на свету происходит устранение части поврелсдений генетических структур клеток, возникающих под действием ультрафиолетового облучения.
Понадобилось почти два десятилетия, чтобы расшифровать открытый А. Кельнером эффект фотореактивации. Оказалось, что ультрафиолетовое облучение обладает способностью нарушать структуру молекул дезоксирибонуклеиновой кислотыты (сокращенно ДНК - см. Нуклеиновые кислоты), несущих генетическую информацию. Молекула ДНК содержит четыре типа так называемых азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин и тимин - и состоит из двух нитей, закрученных в спираль. Нередко в одной нити одинаковые основания располагаются рядом. Под действием ультрафиолетового облучения в части азотистых оснований разрываются химические связи и, если это происходит, например, в расположенных рядом тиминовых основаниях, то они соединяются друг с другом, образуя так называемый димер тимина. Димеры тимина резко нарушают структуру двойной спирали ДНК, в результате чего изменяется смысл генетической записи, что приводит либо к наследственным дефектам, передающимся в дальнейшем потомкам, либо к гибели клетки. Для «лечения», устранения этих повреждений в некоторых клетках имеются специальные ферменты, названные фотореактивирующими. Эти ферменты способны «узнавать» в ДНК поврежденные ультрафиолетовым облучением участки, присоединяться к ним и разрушать возникшие между двумя тиминами связи, восстанавливая исходную (нормальную) структуру ДНК. Однако «лечебный эффект» фотореактивирующих ферментов - расщепление сцепленных участков молекулы ДНК и восстановление ее исходной нормальной структуры - проявляется только при участии световой энергии. Тогда отсюдова, свет играет в этих процессах роль активирующего фактора, запускающего реакцию фотореактивации. До сих пор это остается единственным примером биохимических реакций, в которых активатором выступает световая энергия.
Первоначально способность к фотореактивации была обнаружена у микроорганизмов, в дальнейшем фотореактивирующие ферменты были найдены в клетках некоторых рыб, птиц, амфибии, насекомых, высших растений и водорослей. Длительное время этот вид репарации не удавалось обнаружить у млекопитающих и человека. Только в 1969 году было доказано, что способностью к фотореактивации обладают клетки сумчатых животных. Объясняли этот факт особенностями биологии этих древнейших обитателей Земли: полагали, что наличие фотореактивирующего фермента у сумчатых животных имеет исключительную важность, так как только у них (среди других млекопитающих) зародыш подвергается действию солнечного света (в том числе и ультрафиолетового облучения) в процессе переноса его в сумку матери. Исследования последних лет указывают на возможность наличия фотореактивирующего фермента в клетках кожи человека; может быть, поэтому массивное ультрафиолетовое облучение, например при загаре, не вызывает повреждений генетического аппарата человека.
Темновая репарация , в отличие от фотореактивации, универсальна. Она устраняет различные структурные повреждения ДНК, появляющиеся в результате разнообразных радиационных и химических воздействий. Способность к темновой репарации обнаружена у всех клеточных систем и организмов. Способность клеток микроорганизмов восстанавливать генетические повреждения в темноте была обнаружена в 1955 году, но детали этого процесса стали выясняться только начиная с 1964 года. Оказалось, что механизмы темновой репарации принципиально отличны от механизма фотореактивации. Первое отличие заключается в том, что если во время реакции на свету фотореактивирующий фермент расщепляет сцепленные ультрафиолетовым облучением участки молекулы ДНК, то в ходе темновой репарации поврежденные участки удаляются из молекулы ДНК. Второе отличие связано с числом «вылечиваемых» повреждений. Фотореактивирующий фермент активен в отношении только одного типа повреждений ДНК - образования димеров тимина под действием ультрафиолетового облучения. Ферменты же, осуществляющие темновую репарацию, способны устранять различные структурные нарушения ДНК, появляющиеся вследствие всевозможных воздействий на клетки - и химических, и радиационных. В результате темновой репарации осуществляется своеобразное молекулярное «хирургическое» вмешательство: поврежденные участки «вырезаются», а образовавшиеся «бреши» заполняются путем локального (местного) синтеза или обмена участками между поврежденной и неповрежденной нитями ДНК, в результате чего и восстанавливается ее исходная нормальная структура. Темновая репарация осуществляется под контролем большого числа ферментов, каждый из которых отвечает за определенный этап этого сложного процесса. Детально изучены два типа темновой репарации - эксцизионная и пострепликативная. При эксцизионной репарации поврежденный участок ДНК вырезается и замещается до начала очередного цикла размножения клетки, точнее до начала удвоения (репликации) молекул ДНК. Биологический смысл этого процесса состоит в том, чтобы предупредить закрепление у потомства наследственных изменений (мутаций) и последующее размножение измененных форм. Эксцизионная репарация - наиболее экономичная и эффективная форма репарации генетической. установлено, что при ее нормальном функционировании у микроорганизмов до начала репликации ДНК удаляется до 90% имеющихся генетических повреждений, из клеток высших организмов - до 70%. Эксцизионная репарация осуществляется в несколько этапов.
Сначала специальный фермент «надрезает» одну из нитей ДНК, вблизи от поврежденного участка, затем поврежденный участок удаляется полностью, а образовавшуюся «брешь» заполняют специальные ферменты (ДНК-поли-меразы), которые поставляют недостающие звенья, заимствуя их из неповрежденной нити. Способность к эксцизионной репарации установлена у клеток микроорганизмов, высших растений и животных, а также у человека.
Пострепликативная репарация - последняя возможность для клетки устранить имеющиеся генетические повреждения, защитить потомство от изменения наследственных признаков. Если в ДНК возникает так много повреждений, что в ходе эксцизионной репарации клетка не успевает их полностью устранить, или если повреждены гены, определяющие возможность эксцизионной репарации, то в процессе размножения (удвоения, репликации) ДНК в дочерних нитях на месте повреждений, имеющихся в материнской нити,образуются «бреши». Это происходит в силу того, что фермент, ведущий репликацию ДНК (синтез дочерней нити на материнской нити ДНК), не может «прочесть» искаженную информацию в поврежденной точке материнской нити. Поэтому, доходя до поврежденного места, оставшегося неисправленным во время эксцизионной репарации, этот фермент останавливается, затем медленно (со скоростью в сотни раз меньшей, чем обычно) проходит через зону повреждения и возобновляет нормальный синтез дочерней нити, отступя от этого места. Так происходит во всех точках, где материнская нить ДНК остается поврежденной к началу репликации. Конечно, если число повреждений слишком велико, репликация останавливается полностью и клетка погибает. Но и существовать с молекулами ДНК, несущими бреши, клетка долго не может. Поэтому после репликации, но перед делением клетки начинается процесс пострепликативной репарации. Перед делением клетки в ней образуются две двунитевые молекулы ДНК. Если одна из них несет в какой-либо точке повреждение в одной нити и брешь в противоположной нити, то в другой двунитевой молекуле ДНК обе нити в данной точке будут нормальными. В этом случае может произойти обмен участками ДНК - рекомбинация (см. Ген, обмен генами): неповрежденный участок будет вырезан из нормальной молекулы ДНК и вставлен на место поврежденного участка в другой молекуле, благодаря чему поврежденный генетический материал будет заменен нормальным. Вслед за этим спец. ферменты (ДНК-полимеразы) заделают «бреши» (теперь они смогут это сделать, т. к. в обеих молекулах в данном месте повреждения будут отсутствовать), вновь синтезированные и старые нити будут соединены друг с другом, и исходная структура ДНК будет в результате этого полностью восстановлена. В соответствии с природой процесса, связанного с осуществлением рекомбинации, этот тип пострепликативной репарации называют также рекомбинационным.
По-видимому, изложенный механизм - не единственный путь восстановления нормальной структуры ДНК после ее удвоения (репликации). Во всяком случае известен механизм, при котором в бреши вставляются звенья, не соответствующие исходной структуре репарируемой ДНК, т. е. возникают мутации. Не исключено, что это происходит в тех случаях, когда клетка по тем или иным причинам не может репарировать свою ДНК ни одним из описанных выше способов и ей остается последний шанс - или выжить ценой появления мутаций, или погибнуть. Пока еще недостаточно изучено взаимодействие различных систем репарации, регуляция их активности в клетке и точное время работы. Обнаружено, что в некоторых случаях в клетке происходит координированное действие ферментов эксцизионной и постреплика-тивной репарации. Например, если две нити ДНК соединяются между собой (сшиваются), что происходит при действии многих ядов (например, отравляющего вещества иприта), то сначала реакцию репарации начинает фермент эксцизионной репарации, надрезающий одну нить ДНК, а затем в действие вступают ферменты пострепликативной репарации, завершающие процесс.
Системы ферментов пострепликативной репарации обнаружены в клетках человека. Пока еще не выяснено окончательно, каковы точные ферментативные механизмы, обеспечивающие этот вид репарации в клетках человека, однако известно, что рекомбинация и случайное заполнение брешей с возникновением мутаций могут осуществляться в клетках человека. Не ясна также относительная эффективность известных процессов репарации генетической. Установлено, например, что облученные ультрафиолетовым светом клетки кишечной палочки, при условии нормального функционирования системы эксцизионной репарации, способны удалять из ДНК до 1000 повреждений. При появлении в ДНК большего числа повреждений клетка погибает. Если же система эксцизионной репарации выведена из строя, то за счет пострепликативной репарации может быть удалено лишь около 100 повреждений. Если же обе системы репарации отсутствуют, клетка погибает от единственного повреждения, возникающего в ДНК.
Репарация и мутации. После, в первых исследованиях репарации генетической была установлена тесная связь между устранением поврежденных участков и уменьшением частоты мутаций. Позже было доказано, что нарушения в активности ферментов репарации приводят к резкому возрастанию числа мутаций. Вместе с тем в настоящее время установлено, что мутации могут появляться и в ходе самих процессов репарации генетической из-за «ошибок» в работе репарирующих ферментов. Хотя наибольшее признание получила гипотеза о том, что репарационные процессы осуществляются преимущественно безошибочно и только та реакция пострепликативной репарации, в ходе которой в бреши застраиваются случайные основания, вызывает мутации, накапливается все большее число экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что даже относительно малое число ошибок репарации приводит к появлению значительного числа мутаций, выявляемых как в нормальных (естественных) условиях, так и в случае воздействия на клетки повреждающих факторов.
Репарация на разных этапах индивидуального развития организмов. Способность к осуществлению того или иного вида репараций генетических может изменяться на разных этапах развития организмов. Исследования показывают, что максимальная эффективность всех процессов репарации у млекопитающих (включая человека) проявляется в момент эмбрионального (внутриутробного) развития и на начальных этапах роста организма. Например,длительное время не удавалось найти реакцию эксцизионной репарации у грызунов (хомячок, крыса, мышь и другие) и лишь недавно было обнаружено, что этот вид репарации имеет место на эмбриональной стадии развития и прекращается на более поздних стадиях. Нередко осуществляется только в делящихся клетках, например в формирующихся нервных клетках зародыша. Если создать условия, при которых деление этих клеток подавлено, то устраняется и репарация однонитевых разрывов ДНК, вызванных, например, рентгеновским облучением.
Нарушения репарации и болезни человека. В 1968 г. английским ученым Д. Кливером было доказано, что наследственная болезнь человека - пигментная ксеродермия, признаками которой являются покраснение, образование наростов, нередко со злокачественным перерождением участков кожи на месте облучения солнечным светом, а также нарушения зрения, нервной системы и другие, обусловлена дефектом в активности ферментов эксцизионной репарации. В дальнейшем было установлено, что еще некоторые наследственные болезни человека обусловлены нарушениями процессов репарации генетической. К числу этих заболеваний относится синдром Хатчинсона, при котором развивается карликовость, преждевременное старение и прогрессирующее слабоумие. Повреждением генов, кодирующих ферменты репарации, обусловлено возникновение ряда форм такой относительно распространенной болезни, как системная красная волчанка и другие.
Изучение молекулярной природы этих заболеваний дает основание надеяться на относительно быструю разработку методов их лечения. Успехи в этом направлении зависят как от исследования деталей процессов репарации генетической и изучения возможности выделения из нормальных организмов (в особенности микробов) активно работающих ферментов с последующим введением их в организм больного, так и от методов замещения больных генов здоровыми (смотреть Инженерия генетическая). Если второй путь пока остается только в области гипотез, то в первом направлении начата экспериментальная работа. Так, японские исследователи К. Танака, М. Бекгучи и И. Окада в конце 1975 г. сообщили об успешном использовании одного из репарирующих ферментов, выделенных из клеток бактерий, зараженных бактериальным вирусом, для устранения дефекта в клетках, взятых от больного, страдающего пигментной ксеродермией. Для того чтобы этот фермент мог успешно проникнуть в клетки человека, культивировавшиеся в искусственных условиях, был использован убитый вирус Сендай. Однако до настоящего времени подобные работы не удается проводить на организме человека. Другое направление связано с разработкой способов ранней диагностики болезней, обусловленных дефектами репарирующих ферментов.
Несмотря на высокую точность работы ферментов, осуществляющих репликацию ДНК, а также на существование механизма корректорской правки, при синтезе новых цепей ДНК все же происходят ошибки, связанные с включением в их состав некомплементарных нуклеотидов. Кроме того, молекулы ДНК подвергаются в клетках воздействию разнообразных физических и химических факторов, нарушающих их структуру. К числу наиболее часто возникающих повреждений ДНК можно отнести следующие:
Разрыв (b-N)-гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой (депуринизация), который чаще всего является следствием повышения температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10 000 актов депуринизации ;
Спонтанное дезаминирование остатков цитозина и аденина с образованием, соответственно, остатков урацила и гипоксантин (примерно 100 событий на геном в сутки);
Алкилирование азотистых оснований под действием химических веществ особого класса (алкилирующих агентов );
- интеркаляция (встраивание) некоторых соединений между соседними парами нуклеотидов;
Образование ковалентных сшивок между цепями ДНК под действием бифункциональных агентов;
Образование, возникающих при поглощении ультрафиолетового света (УФ) циклобутановых димеров (рис. 2.2) между соседними пиримидинами в цепи.
Большинство перечисленных повреждений нарушает процессы репликации и экспрессии генов, например, каждый тиминовый димер в ДНК E. coli задерживает репликацию на 10 с. Кроме того, эти повреждения являются источником мутаций, если их исправление не осуществится до начала репликации ДНК.
Чаще всего подобные нарушения происходят лишь в одной из нитей ДНК, при этом во второй нити напротив повреждения в большинстве случаев содержится «правильная» последовательность, которая может служить матрицей для исправления ошибок. Таким образом, двойная спираль ДНК, а также то, что в ней закодирована информация о структуре репарационных ферментов, делает возможным уникальный механизм исправления ошибок - репарацию, характерный только для одного класса молекул - ДНК.
Репарационных систем и механизмов, существующих у разных организмов, очень много, среди них есть такие, которые специфичны лишь для исправления повреждений одного рода, а есть и менее специфичные. Для удобcтва все известные к настоящему времени репарационные процессы можно разделить на две категории: 1) те, что не требуют участия репликации и представляют собой непосредственное исправление нарушений в ДНК; 2) более сложные процессы, в ходе которых происходит репарационная репликация. Лучше всего репарационные механизмы изучены по отношению к исправлению повреждений, вызванных УФ-облучением, - пиримидиновых димеров (рис. 2.2).
Поскольку в наиболее известных процессах репарации последствий УФ-облучения принимают участие зависимые от УФ-света ферменты, репарационные механизмы делят также на световую (способную осуществиться лишь на видимом свету) и темновую (не требующую участия видимого света) репарацию.
К репарационным механизмам прямого исправления повреждений можно отнести дезалкилирование остатков гуанина и мономеризацию циклобутановых димеров между соседними пиримидиновыми основаниями. Дезалкилирование метилгуаниновых остатков относится к темновой репарации и происходит при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и питающих. О 6 -метилгуанин-ДНК-алкил-трансфераза катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента (рис. 2.3).
Расщепление димеров между пиримидиновыми нуклеотидами происходит в процессе фотореактивации - восстановления структуры молекул ДНК, поврежденных УФ-излучением в результате последующего воздействия видимого света (световая репарация). Известна неферментативная коротковолновая фотореактивация, которая заключается в мономеризации димеров при действии ультрафиолетового излучения с длиной волны 240 нм, а также ферментативная фотореактивация. Последнюю обычно и подразумевают под собственно фотореактивацией. Этот процесс требует участия видимого света с длиной волны 300-600 нм и осуществляется под действием специфических фотореактивирующих ферментов (дезоксирибопиримидинфотолиазы). Субстратом фотолиазы служат димеры пиримидиновых оснований, с которыми она образует комплекс (с неповрежденной ДНК фермент не связывается). Используя энергию поглощенного света, фермент разрушает димер без разрыва цепей ДНК (рис. 2.4).
Явление фотореактивации широко распространено в природе и обнаружено даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Фотореактивирующие ферменты найдены у некоторых высших растений и животных, а также у всех изученных бактерий, за исключением Deinococcus radiodurans, который, тем не менее, чрезвычайно устойчив к действию УФ-света: эти бактерии выдерживают дозы в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают E. coli. При полном отсутствии способности к фотореактивации D. radiodurans обладает мощной системой эксцизионной репарации.
Репарационные события, связанные с заменой искаженных участков, не требуют участия видимого света и в них, кроме других ферментов, важную роль играют нуклеазы двух типов: экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют расщепление ДНК, начиная с концов цепей, а эндонуклеазы атакуют цепи во внутренних частях, формируя в ДНК однонитевые разрывы. Среди многообразия разных видов репарации, связанной с репаративным cинтезом ДНК, можно выделить два основных: эксцизионную и пострепликативную репарацию.
Эксцизионная репарация. Отличительной особенностью эксцизионной репарации является удаление поврежденного участка ДНК. Этот вид репарации не столь специфичен в отношении повреждений ДНК, как фотореактивация, и с его помощью могут исправляться не только пиримидиновые димеры, но и многие другие изменения структуры ДНК. Эксцизионная репарация (рис. 2.5, А) представляет собой многоэтапный процесс и включает следующие события:
1) узнавание повреждения в ДНК, которое осуществляется специфическими эндонуклеазами, выполняющими и следующую стадию;
2) надрезание одной цепи ДНК вблизи повреждения - инцизия (осуществляют эндонуклеазы);
3) удаление группы нуклеотидов вместе с повреждением - эксцизия (осуществляют экзонуклеазы);
4) ресинтез ДНК - заполнение образовавшейся бреши (ДНК-полимеразная активность);
5) восстановление непрерывности репарируемой цепи за счет образования ковалентных связей сахарофосфатного остова молекулы.
Лучше всего механизм эксцизионной репарации изучен на примере темнового удаления пиримидиновых димеров из ДНК E. coli, облученных ультрафиолетом. В клетках кишечной палочки за данный процесс отвечают гены uvrA-D (кодируют структуру ферментов, вырезающих участок цепи ДНК с димером), а также polА (определяет структуру ДНК-полимеразы I, осуществляющую репартивный синтез ДНК). Особенностью такого способа эксцизионной репарации является образование одноцепочечных надрезов по обе стороны тиминового димера.
Некоторые организмы используют для репарации повреждений, в том числе связанных с образованием тиминовых димеров, еще одну разновидность эксцизионной репарации, предусматривающую участие в процессе особого фермента - N-гликозилазы. В данном случае первым репаративным событием является расщепление гликозидной связи между поврежденным основанием (например, одним из тиминов в димере, N-алкилированным пурином и др.) и дезоксирибозой. Таким образом, имеет место локальная апуринизация , или апиримидинизация ; возникает так называемый АР-сайт, узнаваемый АР-специфической эндонуклеазой, которая расщепляет фосфоди эфирную связь рядом с АР-сайтом. Затем брешь заполняется с помощью обычного репаративного синтеза.
В бактериальных и эукариотических клетках обнаружен целый ряд различных N-гликозилаз. Например, урацил-ДНК-гликозилаза узнает неправильную пару dG/dU, возникшую в результате спонтанного дезаминирования остатка дезоксицитозина из пары dG/dC. Дезаминирование цитозина может привести при репликации к возникновению мутантной нуклеотидной пары dA/dT, поскольку с точки зрения образования водородных связей урацил ведет себя аналогично тимину. Другой, широко распространенный фермент подобного типа, представляет собой пиримидиновый димер-N-гликозилазу, которая создает апиримидиновый сайт при репарации повреждений, связанных с образованием пиримидиновых димеров.
Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами АР (апуриновые и апиримидиновые)-эндонуклеазами. В клетках про- и эукариот имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз. Некоторые из них надрезают цепь с 3’-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 5’-стороны; в любом случае образуются 3’-гидроксильный и 5’-фосфорильный концы. Это позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны надреза вместе с повреждением.
Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у про- и эукариотических организмов, в том числе у млекопитающих. Нарушения процессов эксцизионной репарации могут приводить к драматическим последствиям. Так, у людей известно наследственное заболевание - пигментная ксеродерма , основными симптомами которого является повышенная чувствительность к солнечному свету, приводящая к развитию рака кожи. У этих больных обнаружены различные дефекты эксцизионной репарации.
Пострепликативная репарация . Этот тип репарации требует участия продуктов генов, задействованных также в рекомбинационных событиях (rec-гены), и не осуществляется в клетках rec-мутантов, поэтому его называют еще и рекомбинационной репарацией. Рекомбинционная пострепликативная репарация основана на процессах репликации и рекомбинации поврежденной ДНК, она наименее специфична из всех рассмотренных типов репарации, поскольку в ней отсутствует этап узнавания повреждения. Это довольно быcтрый способ восстановления нативной структуры ДНК в дочерних (вновь синтезированных) цепях: показано, что репарация происходит уже в первые минуты после облучения. Особенностью данного процесса является сохранение повреждения в исходных (материнских) цепочках (рис.2.5, Б).
Наряду с быстрой существует и медленная пострепликативная репарация, для которой требуется несколько часов. Ее производит система ферментов, которая отсутствует в необлученных клетках и которую индуцирует облуче- ние. Этот механизм получил название SOS-репарации. Его удивительным отличием является значительное увеличение частоты мутаций, несмотря на то что ДНК и так уже повреждена. Это может являться следствием использования в качестве матрицы цепи ДНК, содержащей повреждения.
Пострепликативная репарация существует не только у бактерий, но и в клетках эукариот, в том числе у млекопитающих.
31. Повреждения и репарация днк. Виды повреждений. Способы репарации. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни.
Процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК, называют репарацией. Все репарационные механизмы основаны на том, что ДНК - двухцепочечная молекула, т.е. в клетке есть 2 копии генетической информации. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается повреждённой (изменённой), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.
Процесс репарации происходит в несколько этапов. На первом этапе выявляется нарушение комплементарности цепей ДНК. В ходе второго этапа некомплементарный нуклеотид или только основание устраняется, на третьем и четвёртом этапах идёт восстановление целостности цепи по принципу комплементарности. Однако в зависимости от типа повреждения количество этапов и ферментов, участвующих в его устранении, может быть разным.
Очень редко происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры нуклеотидов комплементарной пары. Такие повреждения в половых клетках не репарируются, так как для осуществления сложной репарации с участием гомологичной рекомбинации требуется наличие диплоидного набора хромосом.
А. Спонтанные повреждения
Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации, дезаминирования нуклеотидов, депуринизации.
Ошибки репликации
Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 10 5 -10 6 нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включёнными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3"- к 5"- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы.
При неправильном спаривании в первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только комплементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях -GATC-. Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её.
Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белков mut S, mut L, mut H . Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи.
К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3"- к 5"- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвёртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.
Депуринизация (апуринизация)
ДНК каждой клетки человека теряет за сутки около 5000 пуриновых остатков вследствие разрыва N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой.
Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АП-сайтом (AP-site, или апуриновый сайт). Термин "АП-сайт" используют также в тех случаях, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания и образуются апиримидиновые сайты (от англ, apurinic-apyrimidinic site ).
Этот тип повреждений устраняет фермент ДНК-инсертаза (от англ, insert - вставлять), который может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв.
Дезаминирование
Реакции дезаминирования цитозина и превращение его в урацил, аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин происходят значительно реже, чем депуринизация, и составляют 10 реакций на один геном в сутки.
Исправление этого вида спонтанного повреждения происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации принимает участие ДНК-N-гликозилаза, гидролизующая связи между аномальным основанием и дезоксирибозой (первый этап), в результате образуется АП-сайт, который распознаёт фермент АП-эндонуклеаза (второй этап). Как только в цепи ДНК возникает разрыв, в работу вступает ещё один фермент - АП-экзонуклеаза, который отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишённую основания (третий этап). В цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза b к З"-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу комплементарности (четвёртый этап). Чтобы соединить два свободных конца (3"-конец встроенного нуклеотида и 5"-конец основной цепи), требуется ещё один фермент - ДНК-лигаза (пятый этап).
Нерепарируемо и поэтому опасно дезаминирование метилированного цитозина. Продукт его спонтанного дезаминирования - тимин,
Б. Индуцируемые повреждения
Индуцируемые повреждения возникают в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы.
Образование димеров пиримидиновых оснований
Под действием УФО двойная связь между С 5 и С 6 атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований полинуклеотидной цепи, в которых произошёл разрыв., равно примерно 3,4 . Это расстояние позволяет освободившимся валентностям между С-С атомами пиримидиновых оснований, расположенных последовательно в цепи ДНК, сформировать циклобутановое кольцо. В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.
Удаление пиримидиновых димеров происходит под действием фотолиазы Фермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру. В фотолиазе есть участок, либо сам поглощающий фотоны (в синей части спектра), либо связывающийся с кофакторами, адсорбирующими свет. Таким образом, свет активирует фотолиазу, которая распознаёт димеры в облучённой ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами связи. После этого фермент отделяется от ДНК.
Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами
Азотистые основания в ДНК могут подвергаться разнообразным повреждениям: алкилированию, окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждённому основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.
В. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни
Репарация необходима для сохранения нативной структуры генетического материала на протяжении всей жизни организма. Снижение активности ферментов репарационных систем приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.
Причиной многих наследственных болезней человека выступает нарушение отдельных этапов процесса репарации.
Пигментная ксеродерма
У больных в системе репарации снижена активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, "застройку" бреши и другие функции. Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи.
Трихотиодистрофия
Заболевание связано с повышенной фоточувствительностью ДНК, вызванной снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная д физическая отсталость; аномалии кожи и зубов.
| " |
Повреждённых при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических реагентов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации.
История открытия
Начало изучению репарации было положено работами Альберта Кельнера (США), который в 1948 году обнаружил явление фотореактивации - уменьшение повреждения биологических объектов, вызываемого ультрафиолетовыми (УФ) лучами, при последующем воздействии ярким видимым светом (световая репарация ).
Р. Сетлоу, К. Руперт (США) и другие вскоре установили, что фотореактивация - фотохимический процесс, протекающий с участием специального фермента и приводящий к расщеплению димеров тимина , образовавшихся в ДНК при поглощении УФ-кванта.
Позднее при изучении генетического контроля чувствительности бактерий к УФ-свету и ионизирующим излучениям была обнаружена темновая репарация - свойство клеток ликвидировать повреждения в ДНК без участия видимого света. Механизм темновой репарации облучённых УФ-светом бактериальных клеток был предсказан А. П. Говард-Фландерсом и экспериментально подтверждён в 1964 году Ф. Ханавальтом и Д. Петиджоном (США). Было показано, что у бактерий после облучения происходит вырезание повреждённых участков ДНК с изменёнными нуклеотидами и ресинтез ДНК в образовавшихся пробелах.
Системы репарации существуют не только у микроорганизмов , но также в клетках животных и человека , у которых они изучаются на культурах тканей . Известен наследственный недуг человека - пигментная ксеродерма , при котором нарушена репарация.
Источники повреждения ДНК
Основные типы повреждения ДНК
Устройство системы репарации
Каждая из систем репарации включает следующие компоненты:
- ДНК-хеликаза - фермент, «узнающий» химически изменённые участки в цепи и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения;
- ДНКаза (дезоксирибонуклеаза) - фермент, "разрезающий" 1 цепочку ДНК (последовательность нуклеотидов) по фосфодиэфирной связи и удаляющий повреждённый участок: экзонуклеаза работает на концевые нуклеотиды 3` или 5`, эндонуклеаза - на нуклеотиды, отличные от концевых;
- ДНК-полимераза - фермент, синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого;
- ДНК-лигаза - фермент, замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность.
Типы репарации
Прямая репарация
Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты , способные быстро (как правило, в одну стадию) устраняют соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов . Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза , которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина .
Эксцизионная репарация
Эксцизионная репарация (англ. excision - вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы по комплементарной цепи. Ферментативная система удаляет короткую однонитевую последовательность двунитевой ДНК, содержащей ошибочно спаренные или поврежденные основания, и замещает их путём синтеза последовательности, комплементарной оставшейся нити.
Эксцизионная репарация является наиболее распространённым способом репарации модифицированных оснований ДНК . Она базируется на распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований (оксиметилурацила, гипоксантина, 5-метилурацила, 3-метиладенина, 7-метилгуанина и т. д.). Для многих гликозилаз к настоящему времени описан полиморфизм, связанный с заменой одного из нуклеотидов в кодирующей последовательности гена. Для ряда изоформ этих ферментов была установлена ассоциация с повышенным риском возникновения онкологических заболеваний [ Chen, 2003 ].
Синтез ДНК происходит по полуконсервативному механизму: каждая цепь ДНК копируется. Синтез происходит по участкам. Существует система, устраняющая ошибки при редупликации ДНК (фоторепарация, дорепродуктивная и пострепродуктивная репарации ). Процесс репарации очень долог: до 20 часов, и сложен. Ферменты – рестриктазы вырезают неподходящий участок ДНК и достраивают его заново. Репарации никогда не протекают со 100% эффективностью, если бы это было, Не существовала бы эволюционная изменчивость. Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с вырезанием. Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной. В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации. Постреплекативная репарация осуществляется путем рекомбенации между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть поврежденной структуры ДНК. Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится.
19.Ген, его свойства. Генетический код, его свойства. Структура и виды РНК. Процессинг, сплайсинг. Роль РНК в процессе реализации наследственной информации.
Ген – участок молекулы ДНК, который несет информацию о структуре полипептидной цепи или макромолекулы. Гены одной хромосомы располагаются линейно, образую группу сцепления. ДНК в хромосоме выполняет разные функции. Существуют разные последовательности генов, есть последовательности генов, контролирующих экспрессию генов, репликацию и др. Есть гены, содержащие информацию о структуре полипептидной цепи, в конечном счете – структурных белках. Такие последовательности нуклеотидов длинной в один ген, называются структурными генами. Гены, определяющие место, время, длительность включения структурных генов – регуляторные гены.
Гены имеют маленький размер, хотя состоят из тысяч пар нуклеотидов. Наличие гена устанавливается по проявлению признака гена (конечному продукту). Общую схему строения генетического аппарата и его работы в 1961 году предложили Жакоб, Моно. Они предложил, что есть участок молекулы ДНК с группой структурных генов. К этой группе примыкает участок в 200пар нуклеотидов – промотор (участок примыкания ДНК зависимой РНК-полимеразы). К этому участку примыкает ген-оператор. Название всей системы – оперон. Регуляция осуществляется регуляторным геном. В итоге белок-репрессор взаимодействует с геном-оператором, и оперон начинает работать. Субстрат взаимодействует с геном регуляторами, оперон блокируется. Принцип обратной связи. Экспрессия оперона включается как единое целое.
У эукариот экспрессия генов не исследована. Причина – серьезные препятствия:
Организация генетического материала в форме хромосом
У многоклеточных организмов клетки специализированы и поэтому часть генов выключена.
Наличие гистоновых белков, в то время как у прокариот - «голая» ДНК.
ДНК – макромолекула, она не может выходить в цитоплазму из ядра и передавать информацию. Синтез белка возможен благодаря м-РНК. В эукариотической клетке транскрипция происходит с огромной скоростью. Сначала возникает про-и-РНК или пре-и-РНК. Это объясняется тем, что у эукариот и-РНК образуется в результате процессинга (созревания). Ген имеет прерывистую структуру. Кодирующие участки – экзоны и некодирующие – интроны. Ген у эукариоических организмов имеет экзонно-интронную структуру. Длина интрона больше длины экзона. В процессе процессинга интроны «вырезаются» - сплайсинг. После образования зрелой и-РНК после взаимодействия с особым белком переходит в систему – информосому, которая несет информацию в цитоплазму. Сейчас экзоно-интронные системы хорошо изучены (например, онкоген - Р-53). Иногда интроны одного гена являются экзонами другого, тогда сплайсинг невозможен. Процессинг и сплайсинг способны объединять структуры, удаленные друг от друга, в один ген, поэтому они имеют огромное эволюционное значение. Подобные процессы упрощают видообразование. Белки имеют блочную структуру. Например, фермент – ДНК-полимераза. Он представляет собой непрерывную полипептидную цепь. Он состоит из собственной ДНК-полимеразы и эндонуклеазы, которая расщепляет молекулу ДНК с конца. Фермент состоит из 2 доменов, которые образуют 2 независимые компактные частицы, связанные полипептидным мостиком. На границе между 2мя генами ферментов находится интрон. Когда-то домены были раздельными генами, а затем – сблизились. Нарушения подобной структуры гена приводит к генным болезням. Нарушение строения интрона фенотипически незаметно, нарушение в экзонной последовательности приводят к мутации (мутации глобиновых генов).
10-15% РНК в клетке - транспортная РНК. Есть комплементарные участки. Есть специальный триплет – антикодон, триплет, не имеющий комплементарных нуклеотидов – ГГЦ. Взаимодействие 2 субъединиц рибосомы и и-РНК приводит к инициации. Имеются 2 участка – пектидильный и аминоацильный. Они соответствуют аминокислотам. Синтез полипептида происходит пошагово. Элонгация – процесс построения полипептидной цепи продолжается пока не дойдет до бессмысленного кодона, тогда происходит терминация. Оканчивается синтез полипептида, который затем поступает в каналы ЭПР. Субъединицы расходятся. В клетке синтезируются различные количества белка.
