Высокоэффективная жидкостная хроматография загрязнителей природных и сточных вод. Высокоэффективная жидкостная хроматография (вэжх) Ультраэффективная жидкостная хроматография

Введение

Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей).

Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами.

Хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа многокомпонентных систем, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного (в том числе промышленного) выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов.

В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают газовую (ГХ, GC) и жидкостную хроматографию (ВЭЖХ, HPLC).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC) используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10 -11 -10 -9 г), что исключительно важно в биологических исследованиях.

Метод ВЭЖХ осуществляется на различных жидкостных хроматографах. Современные жидкостные хроматографы предназначены для разделения сложных смесей веществ на отдельные компоненты и проведения качественного и количественного анализа компонентов разделяемой смеси.

высокоэффективная жидкостная хроматография пропифеназон

В связи с введением в практику фармацевтического производства России GMP. повышается значимость использования современных унифицированных методов анализа, как на предприятиях-производителях:, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств. Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств в странах с развитой фармацевтической промышленностью (США, Англия. Япония, страны ЕС) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод по своим характеристикам соответствует требованиям количественного анализа около 80-90% препаратов.

К технике выполнения любых хроматографических определений предъявляются некоторые общие требования. Прежде всего, необходимо отметить те из них, которые вызывают у начинающих специалистов больше всего вопросов.

1. Кондиционирование помещения. В помещении, где устанавливается жидкостной хроматограф, не должно быть резких колебаний температуры.

Изменение температуры может привести к изменению удерживания, эффективности, и даже селективности разделения.

В летнюю жару в некондиционированных помещениях сильно затрудняется работа с нормально-фазовыми легкокипящими подвижными фазами. В течение дня происходит их постепенное испарение, которое приводит к изменению состава элюента.

При пониженных температурах появляются проблемы в работе с элюентами, обогащенными водой и/или содержащими спирты. Вязкость таких элюентов резко возрастает при понижении температуры, что приводит к повышению давления в системе.

Влияние небольших колебаний температуры на разделение можно устранить, термостатируя хроматографическую колонку, или всю жидкостную систему (что возможно не для всех хроматографов).

2. Качество электропитания. Большинство современных хроматографов оснащено системами стабилизации питания, однако, качество электропитания на месте также должно быть высоким. При недостаточно хорошем электропитании любой запуск серии определений в автоматическом режиме может окончиться неудачей из-за сбоя.

3. Чистота растворителей. Для приготовления подвижных фаз следует применять особо чистые растворители.

В общем случае, требования, предъявляемые к чистоте подвижной фазы, зависят от способа детектирования, метода элюирования (изократического или градиентного), чувствительности детектора к целевому аналиту и его концентрации.

При применении УФ детектирования требования к чистоте растворителей повышаются при переходе к коротковолновому диапазону, менее 230-240 нм. Для изократического элюирования при УФ детектировании на длинах волн, больших 220-240 нм, можно применять растворители марки "ос. ч." и воду-дистиллят. Все реагенты, добавляемые в подвижную фазу, также должны быть достаточно чистыми; кристаллические реагенты перед применением бывает полезно перекристаллизовать.

Для градиентного элюирования необходимо применять растворители марки "для жидкостной хроматографии" ("for liquid chromatography") и воду-бидистиллят. Особые требования в методе градиентного элюирования (в обращенно-фазовой хроматографии) предъявляются к чистоте водного буфера и воды в частности. Прежде всего это связано с тем, что на начальной стадии элюирования адсорбент поглощает из обогащенной водным буфером подвижной фазы загрязняющие компоненты, которые в дальнейшем элюируются и проявляются на хроматограмме в виде "горбов", "порогов" и отдельных пиков, сильно затрудняющих выделение полезных сигналов аналитов.

Наиболее чистые растворители требуются для проведения групповых определений следовых количеств веществ в режиме градиентного элюирования.

Для выполнения определений в градиентном режиме элюирования, а также прецизионных определений в изократическом режиме, подвижная фаза должна применяться однократно, то есть элюат должен сбрасываться или утилизироваться.

При изократическом элюировании, если нет особенных проблем с чувствительностью, отработанный элюент можно применять повторно. Система, в которой элюат после прохождения через детектор поступает обратно в емкость с подвижной фазой, называется "системой с рециклом". Особенно полезной такая система оказывается в случае проведения большого числа рутинных изократических определений на стандартных колонках (250х4.6, 150х4.6) при объемной скорости порядка 1 мл/мин. В этих случаях система с рециклом обеспечивает экономию до 200-300 мл органического растворителя в день. Такая экономная система позволяет применять для анализа очень чистые, дорогие растворители. Вопрос экономии дорогих растворителей стоит менее остро в случае применения микроколонок (80х2, 100х2), поскольку для проведения разделения требуется на порядок меньший объем подвижной фазы.

4. Дегазация растворителей. Растворители, применяющиеся в хроматографии для приготовления подвижных фаз, обычно содержат растворенный воздух. Особенно много воздуха содержит вода.

При работе на недегазированных элюентах пузырьки воздуха попадают в различные узлы жидкостной системы: насос, колонку, капилляры, детектор. При попадании воздуха в жидкостную систему на хроматограмме появляются высокие периодические шумы, вызванные колебанием давления в жидкостной системе. Это приводит к резкому уменьшению чувствительности анализа.

Для удаления воздуха их элюента проводят его дегазацию. Как правило, дегазируют только элюенты для обращенно-фазовых разделений - поскольку водноорганические смеси содержат значительные количества растворенного воздуха. Особенно тщательно дегазация должна осуществляться в случае градиентного элюирования, а также при применении флуориметрического детектирования.

В ходе градиентного элюирования в обращенно-фазовом режиме происходит смешивание двух элюентов - водноорганических смесей различного состава. Смешивание недегазированных элюентов приводит к интенсивному выделению растворенного воздуха, что критично для проведения определения в целом (на хроматограмме пузырьки воздуха регистрируются в виде резких "выбросов" на нулевой линии).

Чувствительность флуориметрического детектирования уменьшается при высоком содержании растворенного воздуха в подвижной фазе (происходит тушение флуоресценции). Таким образом, при применении флуориметрического детектирования дегазации элюента должно уделяться особое внимание.

Существует три основных способа дегазации подвижных фаз для жидкостной хроматографии.

а. Дегазация вакуумом - элюент выдерживают в колбе Кляйзена под вакуумом водоструйного насоса в течение нескольких минут. При проведении дегазации следует избегать кипения элюента.

б. Термическая дегазация применяется для дегазации водноорганических элюентов с высокой долей воды. Подвижную фазу помещают в колбу, которую не герметично закрывают пробкой, и оставляют в водной бане при температуре около 50єС. Через 10-15 минут колбу закрывают пробкой герметично и охлаждают ее под струей воды до комнатной температуры.

в. Дегазация ультразвуком. Подвижную фазу несколько минут обрабатывают ультразвуком, а затем дают ей отстояться в течение 10-15 минут. Этот способ часто бывает недостаточно эффективен для дегазации водноорганических элюентов.

Современные насосные системы для жидкостной хроматографии комплектуются системами автоматической дегазации. Тем не менее, при проведении градиентных анализов обе подвижные фазы лучше дегазировать предварительно и "вручную", по одному из приведенных методов.

5. Фильтрация подвижной фазы. Для обеспечения бесперебойной работы насоса подвижную фазу желательно фильтровать под вакуумом с применением мембранного фильтра.

6. Промывка колонки и узлов жидкостной системы. После работы с водноорганическими подвижными фазами, содержащими соли и кислоты, всю жидкостную систему (включая колонку) следует промыть дистиллированной водой с добавлением 5-10% органического растворителя. Такая промывка делается для того, чтобы в нерабочее время дополнительно не изнашивались узлы жидкостной системы хроматографа и сама неподвижная фаза.

Не проведение такой промывки приводит, прежде всего, к тому, что после остановки насоса на его деталях и стенках кюветы детектора из элюента осаждаются соли. Это, в свою очередь, приводит к неустойчивой работе прибора в целом, а также преждевременному износу движущихся частей насоса. Регулярное отсутствие промывки системы от содержащих соли и кислоты элюентов может привести к сокращению времени жизни неподвижной фазы.

Добавка к промывочной воде некоторого количества органического растворителя необходима для предотвращения биологического загрязнения жидкостной системы.

7. Переход на новую подвижную фазу, которая не смешивается с предыдущей. Такой переход осуществляется через промежуточный растворитель, неограниченно смешивающийся с обеими подвижными фазами - обычно, через изопропанол или ацетон.

Для перехода с водного элюента на неполярный элюент жидкостную систему следует промыть водой с добавкой органического растворителя, затем снять хроматографическую колонку, промыть систему изопропанолом (ацетоном), промыть систему неполярным элюентом, установить новую колонку.

Для обратного перехода снимают хроматографическую колонку, промывают жидкостную систему изопропанолом (ацетоном), затем водным элюентом, затем ставят новую колонку.

При переходе от водного элюента к неполярному следует заранее убедиться, что материал уплотнений насоса рассчитан на работу с неполярными растворителями.

8. Фильтрация пробы. Если анализируемая проба содержит нерастворенную взвесь, то ее желательно отфильтровывать, пропуская пробу через мембранный фильтр, соединенный со шприцем. К сожалению, если пробы мало, менее миллилитра, то профильтровать ее таким способом становится практически невозможно.

При регулярном анализе проб, содержащих взвеси, входной фильтр на колонке (фрит) может засориться, что приведет прежде всего к увеличению давления в системе. В этом случае входной фильтр лучше заменить, а при отсутствии замены - промыть его в органическом растворителе с обработкой ультразвуком в течение 10-15 минут.

Наиболее оптимальным решением проблемы является применение ин-лайн фильтра перед колонкой. Ин-лайн фильтр содержит сменный фрит - такой же, как и на колонке. Замена фрита на ин-лайн фильтре является рутинной операцией, которая может проводиться достаточно часто.

9. Применение предколонок. При регулярном анализе "грязных" проб хроматографическая колонка достаточно быстро загрязняется и теряет свою разделительную способность. Известной альтернативой тщательной пробоподготовки в этом случае является применение предколонки, защищающей основную колонку от загрязнения.

Иногда пробоподготовку целесообразно вообще не проводить, а поставить в линию перед основной колонкой ин-лайн фильтр и предколонку. Преимуществами этой схемы являются простота и экспрессность анализов при меньшей затрате труда и реагентов.

10. Консервация хроматографических колонок. Перед достаточно длительным хранением хроматографические колонки промываются и заполняются растворителем, вполне определенным для каждого типа неподвижной фазы.

Так, хроматографические колонки для работы в нормально-фазовых системах обычно заполняются высококипящим углеводородом, например, изооктаном. Обращенные фазы промывают водой и заполняют ацетонитрилом, или на небольшой скорости подачи - изопропанолом. Фазы, предназначенные для работы с водными буферами, заполняются водой с небольшой добавкой азида натрия (бактериостатика).

Инструкции по хранению колонки могут указываться в ее паспорте.

11. Хранение водных буферов. В случае проведения рутинных определений бывает достаточно удобно готовить сразу большой объем водного буфера для приготовления подвижной фазы. К сожалению, водный буфер не может храниться больше нескольких дней, если не добавить в него азид натрия, бактериостатик. Очень плохо хранятся подвижные фазы на основе фосфатного буфера.

Иногда большой объем водного буфера готовят для того, чтобы "повысить воспроизводимость анализа". Вообще говоря, при таком подходе вопроизводимость анализа не повышается, а вот проблемы с хранением буфера появляются неизбежные.

Вообще же говоря, ответ на вопрос - готовить ли водный буфер на неделю или на один день? - определяется исключительно принципом удобства.

12. Регулярность проведения калибровки. Как правило, калибровку по стандарту проводят каждый день, или же каждый раз при приготовлении нового элюента.

Калибровка проводится при достижении стационарного состояния хроматографической системы; считываемыми параметрами являются время удерживания пика стандарта, его площадь (при спектрофотометрическом детектировании - на опорной длине волны), спектральные отношения (при применении сканирующего или диодно-матричного спектрофотометрического детектора).

В начале работы стандарт может быть проанализирован дважды - для подтверждения воспроизводимости времени удерживания.

1. Определение компонентов препарата "БИЦИЛЛИН-3" методом ВЭЖХ

Бициллин-3 является пенициллином пролонгированного действия и представляет собой смесь натриевой, новокаиновой и бензатиновой солей бензилпенициллина (БП). По действующей ВФС 42-3034-98 определение БП в препарате проводят с помощью ВЭЖХ, новокаин определяют спектрофотометрически, а бензатин (N,N1-дибензилэтилендиамин) экстрагируют эфиром из водного раствора, насыщенного хлоридом натрия. После выпаривания эфира бензатин определяют титрованием хлорной кислотой.

В Европейской Фармакопее содержание БП и бензатина в бензатиновой соли БП определяют с помощью градиентной ВЭЖХ в смеси метанола с раствором фосфата натрия при рН 3,5.

Цель работы - разработка метода ВЭЖХ в изократическом режиме для определения компонентов в бициллине-3.

Экспериментальная часть

Использовали бициллин-3 производства АКО "Синтез" (Курган). Исследование проводили на хроматографе фирмы "Waters" (США) с насосом модели 510, УФ-детектором модели 481 и инжектором модели 7125 (Rheodyne) с дозирующей петлей вместимостью 50 мкл. Для детектирования использовали длину волны 214 нм, при которой хорошо детектируются все анализируемые соединения. Регистрацию хроматограмм и расчет площадей пиков и основных параметров удерживания проводили с помощью персонального компьютера с аналого-цифровым преобразователем и программой "Мультихром".

Был изучен обращеннофазный вариант метода ВЭЖХ на колонке "Luna C18 (2)" размером 250 х 4,6 мм фирмы "Phenomenex" (США), поскольку колонка зарекомендовала себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков органических аминов. С этой же целью в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с буферным раствором, содержащим в качестве одного из компонетов триэтиламин, имеющим pH 5,0.

Исходный раствор для приготовления подвижной фазы - 2,5 М раствор фосфорной кислоты, который титровали триэтиламином до рН 5,0. Буферный раствор для ВЭЖХ получали разбавлением исходного раствора водой в 10 раз.750 мл полученного буферного раствора смешивали с 250 мл ацетонитрила. При этом значение кажущегося рН подвижной фазы повышалось до 5,7. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Хроматографирование проводили при комнатной температуре. Время анализа 20 мин.

Поскольку входящие в состав препарата компоненты различаются по кислотно-основным свойствам - БП является кислотой, а новокаин и бензатин - основаниями, при увеличении рН их времена удерживания в интервале рН, где их ионизация меняется, сдвигаются в разные стороны. Поэтому путем изменения рН легко подобрать удобное удерживание анализируемых компонентов. Однако увеличение рН приводит к заметному ухудшению формы пика бензатина, а уменьшение - к недостаточному разрешению новокаина и продуктов гидролиза БП. Разделение компонентов бициллина-3 при указанных выше условиях представлено на рисунке. Времена удерживания новокаина, бензатина и БП составляли 4,2, 11,6 и 14,8 мин соответственно.

Существенным является выход пика новокаина между 2 пиками, представляющими собой продукты гидролиза БП. В связи с этим для лучшего разделения компонентов рекомендуется добавлять в подвижную фазу небольшие количества 2,5 М растворов фосфорной кислоты или триэтиламина и контролировать разделение хроматографированием смеси новокаина и БП, раствор которого хранился около суток при комнатной температуре.

Для количественного определения 20-25 мг бициллина-3 вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в 20% водном растворе ацетонитрила. Использование для растворения метанола или его растворов вело к частичному метилированию БП. Увеличение концентрации ацетонитрила приводило к уширению пика новокаина. Верхний предел концентрации лекарственного вещества ограничен его растворимостью. Калибровочные графики для БП и бензатина получали с использованием натриевой соли БП и диацетата бензатина после соответствующего пересчета. Калибровочный график для БП линеен в области 0,1-0,5 мг/мл, для бензатина и новокаина - в области 0,01-0,05 мг/мл. Результаты определения компонентов в 5 сериях препарата представлены в табл.1, где каждое значение представляет собой среднее из 5 определений. Относительное среднее квадратичное отклонение составило 1,6% для новокаина, 3,4% для бензатина и 1,4% для БП.

Из табл.1 следует, что результаты количественного определения с помощью ВЭЖХ укладываются в допустимые пределы, регламентируемые НД.

Для подтверждения правильности предложенной методики были проанализированы компоненты бициллина-3 в модельных смесях, приготовленных смешением натриевой соли БП, бензатина диацетата и новокаина. Результаты приведены в табл.2. Результаты пересчитаны на исходные компоненты.

Каждое значение в графе "Найдено" табл.2 - средний результат 3 определений. Средняя величина относительного отклонения составила 2,2 % для бензатина, 0,9 % для новокаина и 0,8 % для БП, что коррелирует с относительными средними стандартными отклонениями, найденными при анализе компонентов в реальных пробах. Для бензатина разброс результатов несколько выше, чем для остальных компонентов, что объясняется низкой высотой и неправильной формой пика и соответственно большей ошибкой интегрирования. Другой причиной относительно больших ошибок при определении бензатина может явиться эффект памяти инжектора при анализе сильно адсорбирующихся веществ. Однако и такой разброс, несколько превышающий принятый для анализов с помощью метода ВЭЖХ, вполне допустим для определения бензатина.

Выводы

1. Разработана методика обнаружения и количественного определения компонентов в препарате "Бициллин-3".

2. Методика проверена на ряде серий препарата и подтверждена анализом модельных смесей известного состава.

2. ВЭЖХ в анализе препаратов, содержащих пропифеназон

Пропифеназон (4-изопропил-2,3-диметил-1-фенил-3-пиразолин-5-он; изопропилантипирин) относится к ненаркотическим анальгетикам пиразолонового ряда и входит в состав комбинированных безрецептурных препаратов. В настоящее время в лечебной практике широко используются таблетки каффетин (состав: пропифеназона-0,21 г, парацетамола-0,25 г, кофеина-0,05 г, кодеина фосфата-0,01 г) и саридон (парацетамола-0,25 г, пропифеназона-0,15 г, кофеина-0,05 г). Согласно существующей нормативной документации для подтверждения подлинности таблеток каффетина используется хроматография в тонком слое сорбента. Количественное определение предложено проводить в отдельных навесках препарата разными для каждого компонента методами: с помощью спектрофотометрии, титриметрии, сочетание тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. В нормативной документации на саридон парацетамол, кофеин и пропифеназон определяют методом ВЭЖХ на колонках длиной 12,5 см с сорбентом Merck Lichrospher C18 и подвижной фазой состава: метанол-0,01 М фосфорная кислота в соотношении 30: 70.

Цель настоящей работы - разработка методик обнаружения и количественного определения компонентов таблеток каффетина и саридона с помощью ВЭЖХ.

В работе использовали таблетки каффетина производства "Алкалоид Скопье" (Республика Македония), саридона производства "Лаборатория Рош Николас С. А.", Гайярд (Франция) и субстанции компонентов, входящих в их состав. Исследование проводили на отечественном микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром-4" с УФ-спектрофотометрическим детектором, колонкой длиной 8 см с обращенно-фазовым сорбентом Сепарон-С18 в качестве неподвижной фазы. Полярный характер анализируемых соединений, их хорошая растворимость в воде и ацетонитриле обусловили выбор водно-ацетонитрильных смесей в разных соотношениях в качестве подвижной фазы. Были испытаны подвижные фазы ацетонитрил - вода в соотношениях 9: 1; 7: 3; 6: 4; 8: 2 и ацетонитрил-вода-диэтиламин (3: 2: 0,2). Избегали использовать подвижные фазы с объемной долей органического растворителя более 80%, чтобы исключить нормально-фазовые взаимодействия, затрудняющие дальнейшее регулирование состава подвижной фазы. Объемная доля растворителя менее 5% приводит к функциональной неустойчивости подвижной фазы и невоспроизводимости времен удерживания. Введение в состав подвижной фазы диэтиламина в качестве модификатора позволило добиться разделения всех 4 компонентов таблеток каффетин. Известно, что на поверхности октадецилсиликагеля находится значительное количество остаточных силанольных групп, способных к ионообменному взаимодействию. Диэтиламин исключает из хроматографического процесса силанольные группы, улучшает форму пиков, сокращает время анализа и регулирует рН на поверхности силикагеля. Измерение проводили в следующих условиях: масштаб регистрации 2,0, время удерживания 0,8 с, скорость расхода элюента 50 мкл/мин, объем вводимой пробы 3 мкл. Детекцию пиков осуществляли при 2 длинах волн - 238 и 276 нм.

Идентификацию проводили по параметрам удерживания, которые определяли предварительно на стандартных растворах исследуемых веществ.

Компоненты таблеток каффетина разделены при использовании подвижной фазы ацетонитрил-вода-диэтиламин (3: 2,2: 0,2). Время удерживания парацетамола составило 3,08 мин, пропифеназона - 5,73 мин, кофеина - 4,0 мин, кодеина - 4,67 мин.

Компоненты саридона можно также разделить, используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (8: 2). Время удерживания для парацетамола - 3,9 мин, пропифеназона - 5,11 мин, кофеина - 4,44 мин.

Для количественного определения применяли метод абсолютной калибровки. Прямая пропорциональная зависимость концентрации вещества от высоты пика наблюдалась для парацетамола в диапазоне 50-200 мкг/мл, для пропифеназона - 25-128 мкг/мл, кофеина - 20-50 мкг/мл, кодеина - 59-234 мкг/мл.

Метод ВЭЖХ имеет некоторые ограничения в анализе сложных смесей. При одновременном присутствии в смеси веществ в макро - и микроколичествах возникает перегрузка колонки, что оказывает влияние на качество разделения и форму выходящих пиков. В каффетине содержание кодеина фосфата по отношению к парацетамолу и пропифеназону в 21-25 раз меньше, поэтому рекомендуется жидкостная экстракция для отделения кодеина от остальных компонентов таблеток. Предварительно мы установили, что парацетамол, пропифеназон и кофеин извлекаются при однократной экстракции этилацетатом из водных растворов при рН 2,0 в количестве соответственно 87,43, 87,29 и 87,84%, а кодеин полностью остается в водном растворе и для его извлечения и концентрирования необходимо использовать хлороформ при рН 9,0-10,0.

Методика количественного определения парацетамола, пропифеназона и кофеина в таблетках саридона и каффетина.20 таблеток растирают в ступке в мелкий однородный порошок, отвешивают около 0,01 г (точная навеска) порошка растертых таблеток и помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл ацетонитрила и тщательно перемешивают.

Содержимое колбы доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают и фильтруют. Раствор вводят в колонку хроматографа в объеме 3,0 мкл. Содержание парацетамола, пропифеназона и кофеина определяют методом абсолютной калибровки. Результаты определения приведены в табл.1 и 2, из которых видно, что полученные данные укладываются в допустимые пределы содержания по нормативной документации (НД).

Методика количественного определения кодеина фосфата в таблетках каффетина. Около 0,2 г растертых таблеток (точная навеска) растворяют в 20 мл воды, хорошо перемешивают до получения однородного раствора, фильтруют через фильтр для мелких и самых мелких осадков, фильтр промывают 10 мл очищенной воды. Раствор подкисляют 10% раствором серной кислоты до рН 2,0. Экстрагируют трижды этилацетатом порциями по 10 мл. Экстракты отбрасывают. К водному раствору добавляют 25% раствор аммиака до рН 9,0-10,0. Экстрагируют трижды хлороформом порциями по 10 мл. Объединенные хлороформные вытяжки помещают в фарфоровые чашки и испаряют при комнатной температуре. Сухие остатки растворяют в ацетонитриле, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки тем же растворителем.3 мкл полученного раствора вводят в колонку хроматографа и определяют кодеин в описанных условиях. Результаты определения приведены в табл.3.

Для оценки точности предлагаемых методик и проверки воспроизводимости результатов были приготовлены и исследованы модельные смеси. Данные на примере таблеток саридона приведены в табл.4. Как видно из табл.4, относительная погрешность определения не превышает для парацетамола ±1, 19%, пропифеназона ±1,16%, кофеина ±1,63%.

Методика количественного определения компонентов таблеток саридона в модельных смесях. Отвешивают точные навески парацетамола (около 0,08 г), пропифеназона (около 0,05 г) и кофеина (около 0,016 г), переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом объеме ацетонитрила и доводят до метки тем же растворителем. Отбирают аликвоту 2,5 мл и переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем до метки доводят тем же растворителем, перемешивают и фильтруют. Раствор вводят в колонку хроматографа в объеме 3 мкл.

Выводы

1. Разработана методика обнаружения компонентов таблеток каффетина и саридона с помощью ВЭЖХ.

Время удерживания для парацетамола составило 3,08 мин, для пропифеназона - 5,73 мин, кофеина - 4 мин и кодеина - 4,67 мин.

2. Предложен метод ВЭЖХ для количественного определения компонентов таблеток каффетина и саридона.

Относительная ошибка определения составила для парацетамола ±1, 19-1,21%, пропифеназона ±1,16-1,71%, кофеина ±1,22-1,63% и для кодеина ±2,95%.

3. Стандартизация препарата "Аданол"

Фармацевтической фирмой "Полисан" разработан ряд комплексных лекарственных препаратов метаболического действия, стимулирующих обменные процессы головного мозга, в том числе "Цитофлавин" (инъекции, таблетки) и "Аданол". "Аданол" обладает выраженными антигипоксическими и противоишемическими свойствами и является перспективным лекарственным средством для лечения больных с последствиями инсульта. Он представляет собой таблетированную лекарственную форму, покрытую кишечно-растворимой оболочкой.

В его состав входят янтарная кислота (ЯК), пирацетам (Пц), рибоксин (Рб), никотинамид (НА), пиридоксина гидрохлорид (ПГ), рибофлавина мононуклеотид (РФ).

Цель работы - разработка метода качественного и количественного определения ЯК в сложных многокомпонентных смесях на примере препарата "Аданол".

В работе использовали жидкостный хроматограф высокого давления фирмы "Shimadzu" (Япония) с УФ-детектором и колонкой Hypersil BDS C18 фирмы "Supelco Inc." зернением 5 мкм, длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм. Подвижная фаза - водно-органическая фаза на основе фосфатного буфера (рН 2,6-7,0). Длина волны детектирования 206 нм. Режим анализа изократический, скорость элюирования 500 мкл/мин; объем проб 20 мкл. УФ-спектры сняты на спектрофотометре UV mini-1240 фирмы "Shimadzu".

Для количественного определения большинства субстанций, входящих в состав препарата, предложены спектрофотометрические методы анализа. Однако сравнение спектральных характеристик компонентов препарата показало, что области поглощения ЯК, ПГ, НА, Рб и Пц в УФ-зоне перекрывают друг друга (рис.1).

В связи с этим содержание их в смеси нельзя определять методом прямой спектрофотометрии и в таком случае целесообразно использовать метод ВЭЖХ. Только РФ имеет специфическую область поглощения более 350 нм (лmax=373, Е1% 1см=202 и лmax=445 нм, Е1% 1см=243), поэтому для него предложен качественный и количественный анализ спектрофотометрическим методом.

На основе полученных данных выбрана оптимальная рабочая длина волны для анализа 5 субстанций, составляющая лопт=206 нм (см. рис.1). Это значение является максимумом УФ-спектра ЯК, которая обладает наименьшим удельным поглощением (лmax=206 нм Е1% 1см= 5,8) по сравнению с остальными компонентами смеси (см. таблицу).

Поскольку все вещества, входящие в препарат, ионогенны, для их анализа целесообразно применять обращенно-фазную хроматографию с использованием неполярной неподвижной и полярной подвижной фаз. При обращенно-фазной хроматографии ионогенных соединений значение водородного показателя - один из факторов, который существенно влияет на эффективность разделения индивидуальных веществ. При работе с современными обращенно-фазными сорбентами в составе подвижной фазы обычно используют буферные растворы рН от 2,0 до 8,0. Так как выбранное оптимальное значение рабочей длины волны равно 206 нм, то лучше всего применять фосфатный буфер, потому что он не имеет положения в УФ-диапазоне длин волн более 200 нм.

Для изучения поведения ЯК при различных значениях рН были сняты ее спектры в фосфатных буферных растворах рН 7,0 и 2,6 (рис.2). При рН 2,6 наблюдается гипохромный эффект молекулярной формы ЯК - поглощение снижается в 3 раза по сравнению со спектром при рН 7,0 (при этом значении рН диссоциация ЯК полностью подавлена). С учетом этого оптимальным значением рН подвижной фазы является 7,0. Далее было изучено влияние состава и рН подвижной фазы на эффективность разделения компонентов препарата. При рН 2,6 не произошло полного разделения смеси на индивидуальные пики - Пц, На и ПГ не делятся и выходят первыми одним пиком, за ними следуют ЯК и Рб в виде индивидуальных пиков. При рН 5,5 также не было полного разделения компонентов. При рН 7,0 произошло полное разделение компонентов смеси. Все вещества выходили в виде отдельных пиков в следующей последовательности: ЯК, Пц, ПГ, НА и Рб. Однако процесс разделения длителен - 45-50 мин.

Для обеспечения большей элюирующей силы подвижной фазы и ускорения процесса разделения необходимо ввести в ее состав менее полярный органический растворитель. Из раство рителей, наиболее часто употребляемых в качестве элюирующих агентов в ВЭЖХ, по пределу прозрачности в УФ-свете при выбранной рабочей длине волны (лопт = 206 нм) мы могли применить ацетонитрил и метанол, у которых пределы прозрачности равны 195 и 205 нм соответственно.

При введении в состав подвижной фазы 2% метанола время процесса сократилось, однако пик НА имел высокую асимметрию и пик Рб накладывался на хвост пика НА. После снижения концентрации метанола до 1% пики Рб и НА не перекрывались, однако асимметрия пика НА увеличилась. С целью ее снижения в подвижную фазу, содержащую 1% метанола, вводили ацетонитрил.

В результате экспериментов была подобрана подвижная фаза - водно-органическая фаза, состоящая из фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1% метанола и 0,5% ацетонитрила, которая обеспечила эффективное разделение всех 5 компонентов (рис.3). Общее время хроматографирования в этой системе составило 35 мин, а времена удерживания компонентов приблизительно (в мин): у ЯК - 5,3, Пц - 15, ПГ - 19,3, НА - 26, Рб - 31.

Количественное определение проведено методом внешнего стандарта с использованием растворов стандартных образцов индивидуальных компонентов.

Метрологические характеристики предлагаемой методики количественного определения изучены на модельных смесях в 5 повторностях и представлены в таблице.

Как следует из таблицы, с помощью разработанной методики в препарате "Аданол" можно определять все 5 компонентов с относительной ошибкой не более 3% с доверительной вероятностью 95%.

Помимо пиков основных компонентов препарата, на хроматограмме, полученной в вышеописанных условиях, идентифицированы пики гипоксантина и никотиновой кислоты, присутствующих в исходных субстанциях, а также образующихся в процессе гидролиза из Рб и НА соответственно. Таким образом, разработанная методика позволяет качественно и количественно определить эти посторонние примеси в препарате.

Выводы

1. Определены оптимальные условия количественного анализа янтарной кислоты с применением метода ВЭЖХ в многокомпонентной смеси.

2. Разработана методика качественного и количественного анализа компонентов препарата "Аданол", включая примеси, с относительной ошибкой определения не более 3%.

Список использованной литературы

1. М.А. Казьмин, А.В. Михалев, А.П. Арзамасцев "Определение компонентов препарата "БИЦИЛЛИН-3" методом ВЭЖХ" // Фармация - №5 - 2002 - с.5-6.

2. Т.Х. Вергейчик, Н.С. Онегова "ВЭЖХ в анализе препаратов, содержащих пропифеназон" // Фармация - №6 - 2002 - с.13-16.

3. А.Ю. Петров, С.А. Дмитриченко, А.Л. Коваленко, Л.Е. Алексеева "Стандартизация препарата "Аданол" // Фармация - №5 - 2002 - с.11-13.

Дополнительная

1. Барам Г.И., Федорова Г.А. // Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности: Мат. Всес. Конф. - Геленджик, 1990 г. - С.43-44.

2. Кричковская Л.В., Черненькая Л.А. // Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности: Мат. Всес. Конф. - Геленджик, 8-12 октября 1990 г., М., 1990. - С.49.

3. Хроматография: Практическое приложение метода: В 2-х частях. Ч.2 - М.: Мир, 1986. - 422 с.

Введение.

Бурное развитие жидкостной хроматографии в последние 10 лет обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.

Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование сорбентов с размером зерен 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения.

В настоящее время ВЭЖХ по темпам развития вышла на первое место среди инструментальных методов, обогнав даже газовую хроматографию. Важнейшее преимущество ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией - возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе.

Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют в самых различных областях науки и техники. Особенно велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений окружающей среды,а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.

поскольку необходимо учитывать целый ряд весьма специфических тре­бований, обусловленных следующими особенностями мето­дики.

а. Колонки для ВЭЖХ наполняют носителем с очень ма­лым диаметром частиц. В результате при таких объемных ско­ростях растворителя, которые необходимы для быстрого разде­ления пробы, на колонке создается высокое давление.

б. Детекторы, применяемые в ВЭЖХ, чувствительны к флуктуации потока и давления элюента (шумы). Более того, при применении концентрационных детекторов необходима еще более высокая стабильность объемной скорости элюента.

в. Процесс хроматографического разделения сопровождает­ся рядом антагонистических эффектов, так, например, диспер­гирование образца в подвижной фазе ведет к смешению раз­деляемых компонентов и снижает максимальную концентрацию вещества в элюируемом пике (в детекторе). Диспергирование наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы до детектора.

г. Растворители, выполняющие роль подвижной фазы, ча­сто способны вызывать коррозию аппаратуры. Это в первую очередь относится к растворителям, используемым в обращен-но-фазовой хроматографии, которая предпочтительна в биохи­мических приложениях ВЭЖХ.

Специфику ВЭЖХ как инструментальной методики необхо­димо учитывать в процессе разработки, создания и эксплуата­ции этих систем. Для создания коммерческих образцов хрома-тографических систем и их компонентов, достаточно надеж­ных, простых и безопасных в работе с приемлемым соотноше­нием между ценой и техническими характеристиками, потре­бовалось более десяти лет поисков и исследований. Наметив­шиеся в последнее время тенденции к уменьшению колонок (как длины, так и диаметра) заставляют предъявлять новые требования к инструментам.

1.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ

Хроматография - это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их меж­ду двумя" несмешивающимися фазами, одна из которых непо­движна, а другая подвижна. Компоненты образца движутся по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше срод­ство компонента к неподвижной фазе и чем меньше - к подвиж­ной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам достигается основная цель хроматографии - разделение за приемлемый промежуток вре­мени смеси на отдельные полосы (пики) компонентов по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой.

Из этих общих представлений ясно, что хроматографическое разделение возможно, только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во-первых, будут растворены в подвижной фазе и, во-вторых, будут взаимодейст­вовать (удерживаться) с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографи-ческом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействую­щие с неподвижной фазой, пройдут через колонку с подвижной фазой, не разделяясь на компоненты.

Примем условие, что какие-то два компонента растворимы в подвижной фазе и взаимодействуют с неподвижной фазой, т. е. хроиатографический процесс может протекать без наруше­ний. В этом случае после прохождения смеси через колонку можно получить хроматограммы вида а, б или в (рис. 1.1). Эти хроматограммы иллюстрируют хроматографические разделения, отличающиеся эффективностью (а и б) при равной селективно­сти и селективностью (б и в) при равной эффективности.

Эффективность колонки тем выше, чем уже пик получается при том же времени удерживания. Эффективность колонки изме­ряется числом теоретических тарелок (ЧТТ) N : чем выше эф-

Рис. 1.2. Параметры хрома-тографического пика и рас­чет числа теоретических та­релок:

t R - время удерживания пика; h - высота пика; Wj/j - шири­на пика на половине его высоты

Рис. 1.1. Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селектив­ности колонки:

а - обычная селективность, пониженная эффективность (меньше теоретических тарелок); б - обычные селективность и эффективность; в - обычная эффективность, повышенная селективность (больше отношение времен удерживания компонентов)

фективность, тем больше ЧТТ, тем меньше расширение пика первоначально узкой полосы по мере прохождения ее через ко­лонку, тем уже пик на выходе из колонки. ЧТТ характеризует число ступеней установления равновесия между подвижной и не­подвижной фазами.

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, и длину колонки L (мкм), а также средний диаметр зерна сор­бента d c (мкм), легко получить значения высоты, эквивалент­ной теоретической тарелке (ВЭТТ), а также приведенной вы­соты, эквивалентной теоретической тарелке (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L / N

ПВЭТТ =B3TT/d c .

Имея значения ЧТТ, ВЭТТ и ПВЭТТ, можно легко сравни­вать эффективность колонок разных типов, разной длины, за­полненных разными по природе и зернению сорбентами. Срав­нивая ЧТТ двух колонок одной длины, сравнивают их эффек­тивность. При сравнении ВЭТТ сравнивают колонки с сорбен­тами одинакового зернения, имеющими разную длину. Нако­нец, величина ПВЭТТ позволяет для двух любых колонок оце­нить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения коло­нок, во-вторых, независимо от длины колонок, зернения сорбен­тами его природы.

Селективность колонки играет большую роль в достижении хроматографического разделения.

Селективность колонки зависит от очень многих факторов, и искусство экспериментатора в большой мере определяется умением воздействовать на селективность разделения. Для это­го в руках хроматографиста находятся три очень важных фак­тора: выбор химической природы сорбента, выбор состава рас­творителя и его модификаторов и учет химической структуры и свойств разделяемых компонентов. Иногда заметное влияние на селективность оказывает изменение температуры колонки, меняющее коэффициенты распределения веществ между по­движной и неподвижной фазами.

При рассмотрении разделения двух компонентов на хрома­тограмме и его оценке важным параметром является разреше­ние R s , которое связывает времена выхода и ширину пиков обо­их разделяемых компонентов

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пи­ков, увеличивается по мере возрастания селективности, отра­жаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пи­ков. Поэтому быстрый прогресс жидкостной хроматографии привел к изменению понятия «жидкостная хроматография вы­сокого давления» - оно было заменено на «жидкостную хрома­тографию высокого разрешения» (при этом сокращенная запись термина на английском языке сохранилась HPLC как наибо­лее правильно характеризующее направление развития совре­менной жидкостной хроматографии).

Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эф­фективность повышается, когда используют более мелкий сор­бент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использова­нии более тонких слоев привитой фазы, менее вязких раствори­телей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке может происходить так­же и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соедини­тельных капиллярах инжектор - колонка и колонка - детек­тор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устрой­ствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, ре­акторы-змеевики и др.)- Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте на­ходится мертвый объем: чем уже хроматографическая зова, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое вни­мание следует уделять конструированию той части хроматогра­фа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) - здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматогра­фах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обяза­тельно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается ис­кажение пика, резкое снижение эффективности, следует тща­тельно проинспектировать вновь введенные в систему капилля­ры и другие устройства.

Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструиро­ванные хроматографы пытаются использовать для высокоско­ростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединитель­ных капилляров с внутренним диаметром 0,05-0,15 мм мини­мальной длины, колонок вместимостью 10-1000 мкл, детекто­ров с микрокюветами емкостью 0,03-1 мкл и с высоким быстро­действием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.

1.2. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на ко­лонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k " должен быть больше 0, т. е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть и слишком большим, чтобы получить приемле­мое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбра­на неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень боль­шие k ". Этого добиваются, меняя элюирующую силу раствори­теля.

В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного рас­творителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увели­чивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изо­пропанола. Если содержащие полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более сла­бым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на дру­гие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том^ случае, если данная система не обеспечивает желаемой селек­тивности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропнЬе ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так же подбирают силу растворителя в случае ис­пользования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и ис­ключая опасные для фазы растворители (например и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу раствори­теля увеличивают, повышая содержание в элюенте органичес­кой составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и умень­шают, добавляя больше воды. Если не удается добиться же­лаемой селективности, используют другую органическую состав­ляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных доба­вок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях методом ионообменной хроматографии си­лу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентра­цию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и биологи­ческих смесей, зачастую не удается подобрать силу раствори­теля таким образом, чтобы все компоненты пробы элюирова-лись за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к гра­диентному элюированию, т. е. использовать растворитель, элюи-рующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонен­тов сложных смесей за относительно короткий промежуток вре­мени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.

1.3. РАЗМЕР ЧАСТИЦ СОРБЕНТА, ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Рассматривая размывание в колонке, мы указывали, что эффективность колонки (ВЭТТ) зависит от размера частиц сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ за послед­ние 10-12 лет было обусловлено, во-первых, разработкой спо­собов получения сорбентов с размером частиц от 3 до 10 мкм и с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, ^разра­боткой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хро­матографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насо­сы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способ­ные регистрировать пики малого объема.

Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (ПВЭТТ), может составлять 2 независимо от того, использо­вали ли для упаковки частицы с размером 3, 5, 10 или 20 мкм. В этом случае мы получим соответственно колонки (при стан­дартной длине их 250 мм) эффективностью 41670, 25000, 12500 и 6250 т.т. Кажется естественным выбрать наиболее эффектив­ную колонку, заполненную частицами размером 3 мкм. Однако за эту эффективность придется заплатить использованием при работе очень высокого давления и относительно невысокой скоростью разделения, так как имеющийся насос, скорее всего, будет и^пособен* прокачивать через такую колонку растворитель с высокой объемной скоростью. Здесь мы как раз и сталкива­емся с вопросом о связи размера частиц сорбента, эффективно­сти и проницаемости колонок.

Если выразить отсюда фактор сопротивления колонки--безраз­мерную величину, получим следующее уравнение:

Фактор сопротивления для колонок, упакованных микрочасти­цами одного вида по одному и тому же способу, меняется не­значительно и составляет следующие значения:

Вид частиц ».... Неправильная Сферическая

форма форма

Сухая упаковка. . . . . 1000-2000 800-1200

Суспензионная упаковка. . . 700-1500 500-700

Давление на входе в колонку пропорционально линейной скорости потока, фактору сопротивления колонки, вязкости рас­творителя и длине колонки и обратно пропорционально квадра­ту диаметра частиц.

Применив эту зависимость для вышеописанных колонок с частицами диаметром 3, 5, 10 и 20 мкм и предположив посто­янными линейную скорость потока, фактор сопротивления ко­лонки и вязкость растворителя, получим для колонок равной длины соотношение давлений на входе 44:16:4:1. Таким об­разом, если для обращенно-фазного сорбента с размером час­тиц 10 мкм при использовании систем растворителей метанол - . вода (70:30) обычно на стандартной колонке при расходе рас­творителя 1 мл/мин давление на входе в колонку составляет 5 МПа, то для частиц 5 мкм - 20 МПа и для 3 мкм - 55 МПа. При использовании силикагеля и менее вязкой системы рас­творителей гексан - изопропанол (100:2) значения будут су­щественно ниже: соответственно 1, 4 и 11 МПа. Если в случае обращенно-фазного сорбента применение частиц размером Змкм очень проблематично, а 5 мкм возможно, но не на всех при­борах, то для нормально-фазного проблем с давлением не воз­никает. Следует отметить, что для современной скоростной ВЭЖХ характерно использование более высокого расхода рас­творителей, чем в вышерассмотренном примере, поэтому тре­бования к давлению возрастают еще больше.

Однако в тех случаях, когда для разделения требуется оп­ределенное число теоретических тарелок и желательно осуще­ствить скоростной анализ, картина несколько меняется. Так как длины колонок с сорбентами зернением 3, 5, 10 мкм при равной эффективности будут соответственно 7,5; 12,5 и 25 см, то и соотношение давлений на входе в колонки изменится доЗ,3:2:1. Соответственно продолжительность анализа на таких колонках равной эффективности будет соотноситься как 0,3:0,5:1, т. е. при переходе от 10 к 5 и 3 мкм продолжительность анализа со­кратится в 2 и 3,3 раза. За это ускорение анализа приходится расплачиваться пропорционально более высоким давлением на входе в колонку.

Приведенные данные справедливы для тех случаев, когда сорбенты разного зернения имеют одинаковые кривые распреде­ления частиц по размеру, колонки набиты одинаковым спосо­бом и имеют одинаковый фактор сопротивления колонки. Сле­дует иметь в виду, что трудность получения узких фракций сор­бента возрастает по мере уменьшения размера частиц и что. фракции от разных производителей имеют разный фракционный состав. Поэтому фактор сопротивления колонок будет меняться в зависимости от зернения, типа сорбента, способа упаковки колонок и др.

КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ВЭЖХ ПО МЕХАНИЗМУ РАЗДЕЛЕНИЯ

Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основа­но на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбен­том, обеспечивающим большее или меньшее удерживание ком­понентов в колонке. Механизмы разделения в более или менее чистом виде на практике встречаются достаточно редко, напри­мер, адсорбционный при использовании абсолютно безводного силикагеля и безводного гексана для разделения ароматических углеводородов.

При смешанном механизме удерживания для веществ раз­ного строения и молекулярной массы можно оценить вклад в удерживание адсорбционного, распределительного, эксклюзион-ного и других механизмов. Однако для лучшего понимания и представления о механизмах разделения в ВЭЖХ целесообраз­но рассматривать разделения с преобладанием того или иного механизма как относящиеся к определенному виду хроматогра­фии, например, к ионообменной хроматографии.

2.1.1 АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделение методом адсорбционной хроматографии осущест­вляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на по­верхности активные центры. Различие в способности к взаимо­действию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворите­лем, так и с адсорбентом.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гид-роксильные группы, лежит специфическое взаимодействие меж­ду полярной поверхностью адсорбента и полярными (или спо­собным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодей­ствие между постоянными или индуцированными диполями, об­разование водородной связи вплоть до образования я-комплек-сов или комплексов с переносом заряда. Возможным и доста­точно частым в практической работе является проявление хемо-сорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появ­лению продуктов разложения или необратимой сорбции веще­ства.

Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик ве­щества симметричен и время удерживания не зависит от разме­ра пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую"форму, что приводит к некоторой асиммет­рии пика с образованием хвоста.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко--другие адсорбенты, широко применяющиеся в класси­ческой колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого - недостаточная механическая прочность боль­шинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их я использовать при повышенных давлениях, характерных для вэжх.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находя­щиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свой­ствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей ве­ществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селектив­ности-- тогда предпочтение отдают тому или другому адсор­бенту, более подходящему для данной конкретной задачи. На­пример, оксид алюминия обеспечивает большую избиратель­ность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором си-ликагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов ана­лиза вследствие разложения компонентов пробы либо их необ­ратимой хемосорбции.

2.1.2 Недостатки адсорбционной хроматографии, ограничивающие ее использование

Популярность адсорбционной хроматографии по мере разви­тия метода ВЭЖХ постепенно падала, она все больше заменя­лась и продолжает заменяться на другие варианты, такие, как обращенно-фазная и нормально-фазная ВЭЖХ на сорбентах с-привитой фазой. Какие же недостатки адсорбционной хромато­графии привели к этому?

Прежде всего, это большая длительность процессов уравно­вешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких раствори­телей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из это­го следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности. По этой же причине невозможно использовать градиентное элюирование - возврат к исходному состоянию настолько длителен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необра­тимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмеча-лить в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, на­капливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по- мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую* или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция, имеющая место и в этом случае, приводит к получе­нию хроматограммы, на которой полностью или частично от­сутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому раз­ложению компоненты пробы.

2.2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Распределительная хроматография - это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фа­за) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически пер­выми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основ­ным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на на­чальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесен­ной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также умень­шался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Логическим оказалось привить химическими связями жид­кую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физи­чески невозможен, т. е. превратить носитель и фазу в одно це­лое- в так называемый привито-фазный сорбент.

В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как по­лярными, так и неполярными группами на поверхности.

Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными произ­водителями. Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей техноло­гии, которая обычно составляет «ноу-хау» производства. В ре­зультате большое количество сорбентов, называющихся хими­чески совершенно одинаково (например, силикагель с привитым октадецилсиланом), имеют очень сильно различающиеся хро-матографические характеристики. Это связано с тем, что сили­кагель может иметь поры шире или уже, разную поверхность, пористость, его поверхность до прививки может гидроксилиро-ваться или нет, прививаться могут моно-, ди- или трихлорсила-ны, условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой фазы, используются разные методы удале­ния остатков реагентов, может использоваться или не исполь­зоваться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп.

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии ка одной фирме-произво­дителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хрома-тографические характеристики. Особенно это касается тех слу­чаев, когда такие сорбенты используют для анализа многоком­понентных смесей, содержащих вещества, заметно различаю щиеся по количеству и положению функциональных групп, по* роду функциональности .

Учитывая вышеуказанное, всегда следует стремиться к то­му* чтобы при использовании описанной в литературе методи­ки анализа применять именно тот самый сорбент и те же усло­вия работы. В этом случае вероятность того, что работу не удастся воспроизвести, является минимальной. Если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогич­ной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребу­ется длительная работа по переделке методики. При этом су­ществует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже и после длительной разработки можно не до­биться требуемого разделения. Наличие в литературе многих описанных методик разделения на давно производимых старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и примене­ние по этой причине. Однако в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно при­менительно к веществам, склонным к разложению, хемосорб-ции, перегруппировкам, целесообразно начинать работу на сор­бентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по> новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однород­ное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более со­вершенные окончательные стадии обработки сорбентов.

2.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизи­рующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием спо­собных к ионному обмену противоионов, расположенных в не­посредственной близости к поверхности. Ион введенного образ­ца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обме­нивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство " к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катеонитах. Аниониты имеют на поверхности положительно за­ряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Ка-тиониты соответственно содержат группы с -отрицательным за­рядом, взаимодействующие с катионами.

В качестве подвижной фазы используют водные растворы " солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиа­ка, т. е. системы растворителей, имеющих высокое значение ди­электрической проницаемости е и большую тенденцию ионизи­ровать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографичеоком разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействие с противоположно заря­женными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообмен­ную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы. Можно провести анализ даже нейтральных молекул Сахаров в виде их комплексов с борат-ионом:

Сахар + ВО 3 2 - = Сахар -ВО 3 2 -.

Ионообменная хроматография незаменима при разделении вы­сокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким со­единениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медици­не, биологии, биохимии , для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для раз­деления неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии прово­дят за 20-40 мин с лучшим разделением. Применение ионооб­менной хроматографии в биологии позволило наблюдать за об­разцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к не­правильной интерпретации конечного результата. Интересно ис­пользование данного метода для контроля изменений, происхо­дящих с биологическими жидкостями . Применение пори­стых слабых анионообменников на силикагелевой основе позво­лило разделить пептиды . V

Механизм ионного обмена можно представить в виде сле­дующих уравнений:

для анионного обмена

X- + R+Y- ч ->■ Y-+R+X-.

для катионного обмена |

X+ + R-Y+ ч=* Y++R-X+.

В первом случае ион образца Х~ конкурирует с ионом по­движной фазы Y~ за ионные центры R+ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y+ за ион­ные центры R~ вступают катионы образца Х+.

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо удержи­ваться на колонке и первыми вымываются с нее и, наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюировать из колонки последними. Обычно возникают BTqpH4Hbie взаимодействия не­ионной природы за счет адсорбции или водородных связей об­разца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» ви­де, и поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпири­ческих, а не теоретических закономерностей при ионообменной хроматографии.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

2.4. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Зксклюзионная хроматография представляет собой вариант! жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находя­щимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим " между его частицами.

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени ус­ловно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне прак­тически любых молекулярных масс - от 10 2 до 10 8 , что дела­ет ч его незаменимым для исследования синтетических и биопо­лимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических раствори­телях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах - гель-фильтрационной хроматографией. В данной книге для обоих вариантов принят единый термин, который происходит от английского «Size Exclusion» - исключение по размеру - и в наиболее полной степени отражает механизм процесса.

Детальный разбор существующих представлений о весьма сложной теории процесса эксклюзионной хроматографии прове­ден в монографиях.

Полный объем растворителя в колонке Vt (его часто назы­вают полным объемом колонки, так как Vd не принимает учас­тия в хроматографическом процессе) представляет собой сум­му объемов подвижной и неподвижной фаз.

Удерживание молекул в зксклюзионной колонке определяет­ся вероятностью их диффузии в поры и зависит от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 2.15. Коэффициент распределения Ка, как и в других вариантах хро­матографии, представляет собой отношение концентраций ве­щества в неподвижной и подвижной фазах.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то Kd вещества, для которого обе фазы одинаково до­ступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул С самыми малыми размерами (в том числе и молекул раствори­теля), которые проникают во все поры (см. рис. 2.15) и поэто­му движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживае­мый объем равен полному объему растворителя Vt-

Рис. 2.15. Модель разделения молекул по меру в эксклюзионной хроматографии

Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбен­та, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по-каналам между частицами. Они элюируются из колонки с од­ним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвиж­ной фазы V 0 - Коэффициент распределения для этих молекул ра­вен нулю.

Молекулы промежуточного размера, способные проникать только в какую-то часть пор, удерживаются в колонке в соот­ветствии с их размером. Коэффициент распределения этих мо­лекул изменяется в "пределах от нуля до единицы и характери­зует долю объема пор, доступных для молекул данного размера. Их удерживаемый объем определяется суммой У о и доступной части объема пор.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Хроматографист, начинающий работать в области высоко­эффективной жидкостной хроматографии, должен ознакомиться с основами качественного анализа. Качественный анализ при­меняют для идентификации известного продукта, полученного новым путем или находящегося в смеси с другими продукта­ми." Он необходим при выделении из сложных биологических, химических смесей различных компонентов, что особенно важ­но в медицине, криминалистике, экологии, для контроля за на-| хождением некоторых лекарствен химических продуктов и их метаболитов в биомл.тер.иалах..„. "Знакомство с основами каче­ственного" анализа поможет избежать типичных ошибок, на­пример/отличить примеси в образце от примесей в раствори-теле или проверять чистоту вещества не на одной длине волны спектрофотометра, а на разных и т. д.

Прежде чем приступить к анализу, необходимо установить, весь ли образец элюируется из колонки данной системой ра­створителей или нет. Чтобы быть уверенным в полном элюи-ровании, необходимо собрать всю вытекающую из колонки жидкость, упарить растворитель, взвесить остаток и найти степень извлечения образца.

Идентификацию компонентов в ВЭЖХ можно проводить тремя способами: 1) использовать информацию об удержива­нии; 2) исследовать зоны, полученные при разделении в колон­ке жидкостного хроматографа, методами спектрального или химического анализа; 3) непосредственно подключить спект-ральный анализатор к колонке.

Для регистрации пиков в хроматографии используют удер­живаемый объем V R или время удерживания t R . Обе величины являются характеристикой вещества в данной хроматографиче­ской системе. Так как время удерживания разделяемого веще­ства состоит из времени взаимодействия в колонке и времени прохождения пустых участков трубки, оно меняется от прибора к прибору. Удобно иметь вещество, не удерживаемое данной колонкой, приняв его за стандарт, время и объем удер­живания которого t 0 , V o . Хроматографирование вещества и стандарта необходимо проводить при одних и тех же условиях (давлении и скорости потока). При идентификации по данным об удерживании, известные индивидуальные вещества, которые могут присутствовать в об­разцах, разделяют в той же самой хроматографической систе­ме, и для них получают значения t R . Сравнивая эти значения t R с временем удерживания неизвестного пика, можно обнару­жить, что они либо совпадают, и тогда вероятно, что пики со­ответствуют одному и тому же веществу, либо t R известного вещества не соответствует t R неизвестной зоны. Тогда все же возможна ориентировочная оценка значений t R веществ, не до­ступных для непосредственного измерения степени их удержи­вания. Рассмотрим оба варианта.

В первом случае, очевидно, необходимо предварительное изучение образца для постулирования присутствия в нем кон­кретных веществ. При работе с простыми смесями нетрудно определить, совпадает ли степень удерживания зон образца и известных веществ, или нет, т. е. значения t B одинаковы или различаются. В случае сложных смесей сразу несколько ве­ществ могут элюироваться со схожими значениями t R , и реально получаемые при хроматографическом разделении зоны пере­крываются. В результате получение точных значений t R для различных зон становится невозможным. Надежность иденти­фикации возрастает при повышении разрешающей способности, более тщательном контроле условий разделения, многократном измерении значений t R и усреднении найденных величин. При этом хроматографическое разделение известного и неизве­стного веществ должно чередоваться. При разделении сложных смесей значение t R вещества может изменяться под влиянием матрицы самого образца. Такое воздействие возможно в нача­ле хроматограммы и при перекрывании пиков; возможно также затягивание зон, о чем уже упоминалось.

В подобных случаях следует добавить стандарт к образцу в соотношении 1: 1. Если вещества идентичны, значение t R исходного вещества не изменится, и на хроматограмме полу­чают только один пик. Если имеется прибор с циклической системой хроматографирования, то для надежности идентифи­кации желательно смесь пропускать через колонку несколько раз.

Сведения о степени удерживания можно найти и в литера­туре, однако ценность этой информации ограничена. Так как колонки даже одной партии дают плохую воспроизводимость, литературные значения не всегда соответствуют истинному значению t R на данной колонке. Для адсорбционной хромато­графии возможно, однако, предсказание t R на основании лите­ратурных данных. Другая трудность, связанная с использова­нием литературных значений t R , - сложность их поиска в специальной литературе, хотя библиографические обзоры, пуб­ликуемые в Jornal of chromatography, имеют обновляемый указатель по типам веществ.

Во втором случае, когда времена удерживания известных соединений и зон образца не совпадают, имеется возможность предсказать время удерживания неизвестного компонента. Вполне надежны предсказания относительного удерживания на основании данных о структуре в пространственно-эксклюзионной хроматографии. Менее точны они в адсорбционной, распределительной хроматографии и особенно при работе на химически привязанной фазе. Для ионной и ион-парной хрома­тографии веществ с известной р Ка возможны лишь приблизи­тельные определения значений tR . Всегда легче предсказать от­носительное удерживание или значение *х, чем абсолютные зна­чения k ". Относительные значения t R легче оценить для родствен­ных соединений или производных, например замещенных алкилкарбоновых кислот или производных бензола.

При изократическом разделении гомологов или олигомеров иногда наблюдается следующая закономерность:

\ gk " = A + Bn ,

где А и В - константы для ряда выбранных образцов и для данной хрома-тографической системы (на одной и той же колонке, с такой же подвижной и неподвижной фазами); п - число одинаковых структурных единиц в мо­лекуле образца.

Введение в молекулу образца функциональной группы / бу­дет приводить к изменению k " в первом уравнении на некото­рый постоянный коэффициент а/ в данной хроматографической системе. Можно получить групповые константы а/ для различ­ных замещающих групп /, значения которых будут возрастать при увеличении полярности функциональных групп во всех видах хроматографии, кроме обращенно-фазной, где значения констант будут уменьшаться с увеличением полярности.

Некоторые групповые константы а/ для различных заме­щающих групп / приведены в табл. 9.1.

В адсорбционной хроматографии первое уравнение не всег­да применимо, так как оно справедливо при условии, что все изомеры имеют одно и то же значение k ", что не всегда соблю­дается. Можно, однако, построить график зависимости lgfe" одних и тех же соединений на одной колонке относительно lgfe" тех же соединений, но на другой колонке или относитель­но соответствующих характеристик в тонкослойной хромато­графии, например, lg[(l-Rf ) IRf ].

При сопоставлении данных об удерживании веществ можно использовать значения коэффициента емкости k ", так как на него в отличие от t R не влияют скорость подвижной фазы и геометрические особенности колонки.

Разделение на химически привязанной фазе аналогично разделению по методу распределительной хроматографии с аналогичными фазами, и поэтому данные по экстракции при равновесном состоянии могут быть использованы для пред­сказания времени удерживания.

В ионообменной хроматографии на степень удерживания влияют три фактора: степень ионизации кислот и оснований, заряд ионизированной молекулы и способность вещества из водной подвижной фазы, используемой в ионообменной хрома­тографии, мигрировать в органическую фазу. Последнее зави­сит от молекулярной массы соединения и его гидрофобности. Следовательно, более сильные кислоты или основания сильнее удерживаются при анионообменном или катионообменном раз­делении. При снижении рК а отдельной кислоты, входящей в образец, удерживание возрастает при разделении ряда кислот за счет анионного обмена, а при увеличении р/С о увеличивает­ся удерживание оснований при их разделении за счет катион-ного обмена.

Таким образом, совпадение значений времени удерживания известного вещества с наблюдаемым дает возможность пред­положить их идентичность. Достоверность идентификации воз­растает, если проводить сравнение хроматограмм известного вещества и неизвестного компонента в различных условиях. Если вещества в адсорбционной и обращенно-фазной или ион-нообменной и эксклюзионной хроматографии ведут себя одина­ково, надежность идентификации возрастает. Если достовер­ность идентификации при равенстве относительного удерживания составляет 90%, то при изучении поведения этих же веществ в условиях существенно отличающихся достоверность иденти­фикации составляет уже 99%.

Ценной характеристикой вещества, применяемой при иден­тификации, является отношение сигналов, полученных для данного вещества на двух разных детекторах. Анализируемое вещество после выхода из колонки проходит сначала через первый детектор, затем через второй, а сигналы, поступающие с детекторов, регистрируются одновременно при помощи мно­гоперьевого самописца или на двух самописцах. Обычно при­меняют последовательное соединение ультрафиолетового детек­тора (более чувствительного, но селективного) с рефрактомет­ром, или ультрафиолетового с детектором по флуоресценции, или двух ультрафиолетовых детекторов, работающих на раз­ных длинах волн. Относительный отклик, т. е. отношение сиг­нала рефрактометра к сигналу фотометра, является характе­ристикой вещества при условии, что оба детектора работают в своем линейном диапазоне; это проверяется введением раз­личных количеств одного и того же вещества. Качественную информацию можно получить, работая на фотометрических детекторах, снабженных устройством для остановки потока (Stop flow) и позволяющих регистрировать спектр выходящего" из колонки пика, пока он находится в проточной кювете, сравнивая его со спектром известного соединения.

Значительный интерес при идентификации представляют со­временные, пока еще дорогие, спектрофотометры с диодной решеткой.

Совершенно неизвестное вещество невозможно идентифици­ровать только с помощью высокоэффективной жидкостной хро­матографии, необходимы и другие методы.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Количественная жидкостная хроматография является хоро-(шо разработанным аналитическим методом, не уступающим по точности количественной газовой хроматографии и значительно превышающим точность ТСХ или электрофореза. К со­жалению, в ВЭЖХ не существует детектора, который имел бы близкую чувствительность для соединений различного химиче­ского строения (как катарометр в ГЖХ). Поэтому для полу­чения количественных результатов калибровка прибора обяза­тельна.

Количественный анализ состоит из следующих стадий: 1) хроматографическое разделение; 2) измерение площадей или высот пика; 3) расчет количественного состава смеси на основании хроматографических данных; 4) интерпретация по­лученных результатов, т. е. статистическая обработка. Рас­смотрим все эти стадии.

4.1. ХРМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

При отборе пробы могут быть допущены ошибки. Особенно важно избежать ошибки и отобрать адекватную представи­тельную пробу неоднородных твердых образцов, легколетучих или неустойчивых веществ, а также сельскохозяйственных про­дуктов и биоматериалов. Неоднородные образцы, например, пищевых продуктов, тщательно перемешивают и квартуют. Проводя эту операцию многократно, добиваются однородности пробы.

Погрешности и потери веществ могут быть допущены на стадии экстракции, выделения, очистки и т. д.

Образцы должны быть полностью растворены, а их раст­воры приготовлены с точностью ±0,1%. Растворять образец желательно в подвижной фазе, что исключит возможность осаждения его после введения в хроматограф. Если растворе­ние в подвижной фазе невозможно, то следует применять ра­створитель, смешивающийся с ней, и вводить в хроматограф объемы образца (менее 25 мкл).

Значительные погрешности могут быть при вводе пробы за счет ее фракционирования, утечек и размывания пиков. Размывание пиков вызывает образование хвостов, приводящих к частичному перекрыванию пиков, и как следствие этого к погрешностям при детектировании. Для ввода пробы при ко­личественном анализе предпочтительнее использовать петле­вые клапанные устройства, а не шприцы из-за более высокой точности.и меньшей зависимости от индивидуальных особен­ностей операторов.

При хроматографическом разделении веществ также могут возникнуть осложнения, приводящие к искажению данных: количественного анализа. Возможно разложение или превра­щение пробы во время хроматографического процесса или не­обратимая адсорбция вещества на данной колонке. Важно убедиться в отсутствии этих нежелательных явлений и при не­обходимости провести регенерацию колонки или заменить ее. Перекрывание пиков и образование хвостов также можно уменьшить, изменяя условия хроматографирования.

Нельзя использовать в количественном анализе пики лож­ные или нечеткой формы, а также пики, время выхода которых близко к to , поскольку возможно недостаточное их разделение. Обычно используют пики со значением й"^0,5. Наивысшая эффективность колонки достигается при введении 10~ 5 -10~ 6 г растворенного вещества на 1 г сорбента. При введении боль­ших количеств образца зависимость высоты пика от нагрузки может оказаться нелинейной и потребоваться количественная оценка по площадям пиков.

К существенному искажению результатов хроматографиче­ского разделения приводят погрешности, связанные с детекти­рованием, или усилением. Каждый детектор характеризуется специфичностью, линейностью и чувствительностью. Особенно важна проверка на селективность при анализе микропримесей. Отклик УФ-детекторов может изменяться на вещества со схожими функциональными группами в 10 4 раз. Необходимо от­клик детектора прокалибровать для каждого определяемого вещества. Естественно, что вещества, не поглощающие в УФ-области, не дадут сигнала на самописец при использовании в качестве детектора фотометра. При использовании рефракто­метра возможно появление отрицательных пиков. Кроме того, этот детектор необходимо термостатировать, чего не требуется для УФ-детектора.

Линейностью детектора определяется размер вводимой пробы. Необходимо помнить, что скорость потока через колон­ку, температура колонки и детектора, а также его конструкция влияют на точность количественного анализа. Погрешности при передаче электрического сигнала на выходное устройство (са­мописец), интегратор или на ЭВМ могут возникать за счет наводки шумов, отсутствия заземления, колебания напряжения в сети и т. д.

4.2. ИЗМЕРЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ИЛИ ВЫСОТ ПИКОВ

Высотой пик h (рис. 10.1) называют расстояние от верши­ны пика до базовой линии, его измеряют линейной либо под­считывают число делений на самописце. Некоторые электрон­ные интеграторы и вычислительные машины дают информацию о высоте пиков. Положение базовой линии смещенных пиков находят путем интерполирования значений ординат, соответ­ствующих началу и концу пика (пик 1 и 3 см. рис. 10.1). Для повышения точности необходимо иметь пологую стабиль­ную базовую линию. В случае неразделенных пиков базовую линию строят между началом и концом пика, а не заменяют нулевой линией. Так как высота пиков менее зависит от влия­ния соседних перекрывающихся пиков, оценка по высоте пика точнее, и ее почти всегда используют при анализе микропри­месей.

Площадь пика можно определять различными способами. Рассмотрим некоторые из них.

1. Планиметрический метод заключается в том, что пик обводят ручным планиметром, представляющим собой прибор механически определяющий площадь пика. Метод точен, но трудоемок и плохо воспроизводим. Применение этого метода нежелательно.

2. Метод бумажных силуэтов - пик вырезают и взвешивают. Метод хорошо воспроизводим, но трудоемок, при этом уничто­жается хроматограмма. Применимость его зависит от одно­родности диаграммной ленты. Метод также не может быть широко рекомендован.

4. Метод триангуляции состоит в построении треугольника путем проведения касательных к сторонам пика. Вершина тре­угольника находится выше, чем вершина пика. Увеличение площади, образованной этой продленной вершиной, будет по­следовательным для всей хроматограммы и не слишком по­влияет на точность. Кроме того, некоторая площадь, теряемая при проведении касательных, будет компенсирована. Основание треугольника определяют пересечением касательных с базовой линией, а площадь - произведением 7г основания на высоту. Для определения площадей асимметричных пиков этот метод наилучший. Однако воспроизводимость при построении каса­тельных различными операторами различна и, следовательно; низкая.

5. Метод с применением дискового интегратора основан на электромеханическом приспособлении, присоединенном к само­писцу. Перо, прикрепленное к интегратору, перемещается по полосе внизу ленты со скоростью, пропорциональной переме­щению пера самописца.

Как и при ручном измерении, пик должен оставаться на шкале самописца, однако регулировки, компенсирующие сме­щение базовой линии и неполное разделение смежных пиков, снижает надежность и увеличивает продолжительность ана­лиза.

Метод более точен, чем ручные методы измерения, особен­но при асимметричных пиках, и дает преимущество в скорости. Кроме того, он обеспечивает постоянную количественную за­пись анализа.

6. Методы с применением электронных интеграторов, опре­деляющих площадь пиков и печатающих информацию об этой площади и о временах удерживания, могут включать коррек­цию смещения базовой линии и определять площадь лишь ча­стично разделенных пиков. Основные преимущества - точность, скорость, независимость действия от работы самописца. Инте­граторы имеют память, и их можно программировать для кон­кретного анализа, используя предварительно заложенную про­грамму. К достоинствам интегратора относят его способность использовать поправочные коэффициенты на отклик детектора при пересчете исходных данных о площадях пиков, компенси­руя различие чувствительности детектора к разным веществам. Подобные системы экономят время, улучшают аналитическую точность и полезны для рутинного аналитического анализа.

7. В жидкостной хроматографии широко применяют ЭВМ, измеряющие площади пиков. Они выводят на печать полное сообщение, включая название веществ, площади пиков, време­на удерживания, поправочные коэффициенты на отклик детек­тора и содержание (в масс.%) для различных компонентов образца.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ст. ГФ XI

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуются высоким гидравлическим сопротивлением на входе.

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др. в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий. В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности сорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля. В распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

В зависимости от типа подвижной и неподвижной фазы различают нормально-фазовую и обращенно-фазовую хроматографию. В нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии неподвижная фаза – полярная (чаще всего силикагель или силикагель с привитыми NH 2 — или CN-группами и др.), а подвижная фаза – неполярная (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями – хлороформом, спиртами и т.д.). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. В нормально-фазовой хроматографии элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с ростом ее полярности.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.); подвижная фаза – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциированные в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет различной силы взаимодействия определяемых ионов с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

В хиральной хроматографии происходит разделение оптически активных соединений на отдельные энантиомеры. Разделение может осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз.

Существуют и другие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно, в зависимости от типа подвижной и неподвижной фаз, а также природы определяемого соединения.

Область применения

Высокоэффективная жидкостная хроматография успешно применяется как для качественного, так и для количественного анализа лекарственных средств в испытаниях «Подлинность», «Посторонние примеси», «Растворение», «Однородность дозирования», «Количественное определение». Следует отметить, что хроматография позволяет совмещать в одной пробе несколько испытаний, в том числе «Подлинность» и «Количественное определение».

Оборудование

Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

— узел подготовки подвижной фазы, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации подвижной фазы;

— насосная система;

— смеситель подвижной фазы (при необходимости);

— система ввода пробы (инжектор), может быть ручным или автоматическим (автосамплер);

— хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

— детектор (один или несколько с разными способами детектирования);

— система управления хроматографом, сбора и обработки данных.

Помимо этого в состав хроматографа могут входить: система пробоподготовки и предколоночный реактор, система переключения колонок, постколоночный реактор и другое оборудование.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу подвижной фазы в колонку с заданной скоростью. Состав подвижной фазы и скорость потока могут быть постоянными или меняющимся во время анализа. В случае постоянного состава подвижной фазы процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав подвижной фазы по определенной программе при градиентном элюировании. Насосы для аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяют поддерживать скорость подачи подвижной фазы в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 40 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе подвижной фазы агрессивные компоненты.

Смесители

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из отдельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешение компонентов подвижной фазы в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки подвижной фазы и при изократическом элюировании.

Объем смесителя может влиять на время удерживания компонентов при градиентном элюировании.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными, с возможностью изменения объема вводимой пробы, или дискретными для ввода пробы только определенного объема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен непосредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока подвижной фазы и осуществлять предварительное введение пробы в петлю-дозатор определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл) или в специальное дозирующее устройство переменного объема. Объем петли указан на ее маркировке. Конструкция дискретного инжектора, как правило, позволяет осуществлять замену петли. Современные автоматические инжекторы могут обладать рядом дополнительных функций, например, выполнять функцию станции пробоподготовки: осуществлять смешение и разбавление образцов, проводить реакцию предколоночной дериватизации.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закрытые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитической колонки может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более, внутренний диаметр – от 2 до 10 мм. Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хроматографии. Существуют также капиллярные колонки с внутренним диаметром около 0,3–0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии могут иметь внутренний диаметр 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие колонки (предколонки), выполняющие различные вспомогательные функции, основная из которых — защита аналитической колонки. Обычно анализ проводят при комнатной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и сокращения продолжительности анализа может быть использовано термостатирование колонок при температурах до 80 — 100 °С. Возможность использования повышенной температуры при разделении ограничивается стабильностью неподвижной фазы, поскольку при повышенных температурах возможна ее деструкция.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

• силикагель, оксид алюминия, используются в нормально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном случае – обычно адсорбция;
• силикагель, смолы или полимеры с привитыми кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная и ионная хроматография;
• силикагель или полимеры с заданным распределением размеров пор (эксклюзионная хроматография);
• химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фазами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания ‑ адсорбция или распределение между подвижной и неподвижной фазами. Область применения зависит от типа привитых функциональных групп. Некоторые типы сорбентов могут использоваться как в обращенной, так и в нормально фазовой хроматографии;
• химически модифицированные хиральные сорбенты, например, производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, хитозаны, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень химической модификации. В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан (ODS) или С 18);

– октильные группы (сорбент октилсилан или С 8);

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH 2);

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С 18 .

Сорбенты с привитыми фазами, полученные на основе силикагеля, химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 7,0, если другое специально не оговаривается производителем. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии – 50 мкм и более. Существуют также монолитные колонки, в которых сорбент представляет собой монолит со сквозными порами, заполняющий весь объем колонки.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопических размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются различные способы детектирования. В общем случае подвижная фаза с растворенными в ней компонентами после хроматографической колонки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в ультрафиолетовой или видимой области спектра, флуоресценция, показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физического или физико-химического параметра подвижной фазы от времени.

Наиболее распространенными детекторами в высокоэффективной жидкостной хроматографии являются спектрофотометрические. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне (как правило, 190-600 нм). Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно и детекторы на диодной матрице, позволяющие регистрировать оптическую плотность одновременно во всем рабочем диапазоне длин волн (как правило, 190-950 нм). Это позволяет регистрировать спектры поглощения проходящих через ячейку детектора компонентов.

Флуориметрический детектор применяется для определения флуоресцирующих соединений или не флуоресцирующих соединений в виде их флуоресцирующих производных. Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в ультрафиолетовой области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. Современные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хроматограммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анализируемых соединений.

Для определения соединений, слабо поглощающих в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (например углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать), а также невозможность их использование в режиме градиентного элюирования.

Принцип работы испарительных детекторов лазерного светового рассеяния основан на различии давлений паров хроматографических растворителей, входящих в состав подвижной фазы, и анализируемых веществ. Подвижная фаза на выходе из колонки вводится в распылитель, смешивается с азотом или СО 2 и в виде мелкодисперсного аэрозоля попадает в обогреваемую испарительную трубку с температурой 30 – 160 °С, в которой подвижная фаза испаряется. Аэрозоль из нелетучих частиц анализируемых веществ рассеивает световой поток в камере рассеивания. По степени рассеивания светового потока можно судить о количестве определяемого соединения. Детектор более чувствителен, чем рефрактометрический, его сигнал не зависит от оптических свойств пробы, от типа функциональных групп в определяемых веществах, от состава подвижной фазы и может быть использован в режиме градиентного элюирования.

Электрохимические детекторы (кондуктометрические, амперометрические, кулонометрические и др.). Амперометрический детектор применяют для определения электроактивных соединений, которые могут быть окислены или восстановлены на поверхности твердого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления или восстановления. В ячейке детектора имеется по крайне мере два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлоридсеребрянный или стальной). К электродам прикладывается рабочий потенциал, величина которого зависит от природы определяемых соединений. Измерения могут проводиться как при постоянном потенциале, так и в импульсном режиме, когда задается профиль изменения потенциала рабочего электрода в течении одного цикла регистрации сигнала. В амперометрическом детекторе используют рабочие электроды из углеродных материалов (наиболее часто стеклоуглеродный или графитовый), и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый.

Кондуктометрический детектор используют для детектирования анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Исключительно информативным является масс-спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000 а.е.м.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются также, Фурье-ИК-детекторы, радиоактивности и некоторые другие.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.

Подвижная фаза

Подвижная фаза в высокоэффективной жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию: обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке и регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ. Таким образом, изменяя состав подвижной фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии можно влиять на времена удерживания соединений, селективность и эффективность их разделения.

Подвижная фаза может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав подвижной фазы указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено. В качестве компонентов подвижной фазы могут быть использованы буферные растворы с определенным значением рН, различные соли, кислоты и основания и другие модификаторы.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу подвижной фазы.

В обращено-фазовой хроматографии в качестве подвижной фазы используется вода или водно-органические смеси. Органическими добавками обычно служат полярные органические растворители (ацетонитрил и метанол). Для оптимизации разделения могут использоваться водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные раствор, а также различные добавки в подвижную фазу: фосфорная и уксусная кислоты при разделении соединений кислотного характера; аммиак и алифатические амины при разделении соединений основного характера, и другие модификаторы.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты подвижной фазы, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора подвижная фаза не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.

Подвижная фаза и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившиеся частиц и пузырьки газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В фармакопейной статье должны быть приведены: полное коммерческое наименование колонки с указанием производителя и каталожного номера, размеры колонки (длина и внутренний диаметр), типа сорбента с указанием размера частиц, размера пор, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), состав подвижной фазы и способ ее приготовления, скорость подачи подвижной фазы, тип детектора и условия детектирования (при необходимости параметры используемой ячейки детектора), описание градиентного режима (если используется), включающее в себя стадию переуравновешивания к исходным условиям, время хроматографирования, подробное описание методики и формулы расчета, описания приготовления стандартных и испытуемых растворов.

В случае использования предколоночной дериватизации в автосамплере приводится информацию о программе работы автосамплера. В случае использования постколоночной дериватизации указывается скорость подачи дериватизирующего реагента, объем петли смешения и ее температура.

Модифицированные виды высокоэффективной жидкостной хроматографии

Ион-парная хроматография

Одной из разновидностей обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии является ион парная хроматография – позволяющая определять ионизированные соединения. Для этого в состав традиционной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии подвижной фазы добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами (ион парные реагенты). Для разделения оснований обычно используют алкилсульфаты натрия, для разделения кислот применяют соли тетраалкиламмония (тетрабутиламмония фосфат, цетилтриметиламмония бромид и др.). В ион-парном режиме селективность разделения неионогенных компонентов будет лимитироваться обращено-фазовым механизмом удерживания, а удерживание оснований и кислот заметно возрастает, при этом улучшается форма хроматографических пиков.

Удерживание в ион-парном режиме обусловлено достаточно сложными равновесными процессами, конкурирующими между собой. С одной стороны, за счет гидрофобных взаимодействий и эффекта вытеснения полярной среды подвижной фазы возможна сорбция гидрофобный ионов на поверхности алкилсиликагеля таким образом, что заряженные группы обращены к подвижной фазе. В этом случае поверхность приобретает ионообменные свойства, и удерживание подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. С другой стороны, возможно образование ионной пары непосредственно в объеме элюента, с последующей ее сорбцией на сорбенте по обращено-фазовому механизму.

Хроматография гидрофильного взаимодействия ( HILIC хроматография)

Хроматография гидрофильного взаимодействия используется для разделения полярных соединений, слабо удерживаемых в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве подвижной фазы в этом варианте хроматографии используются водно-ацетонитрильные смеси с добавлением солей, кислот или оснований. Неподвижными фазами, как правило, являются силикагели, модифицированные полярными группами (амино-, диольные, цианопропильные группы и т.д.). Более полярные соединения удерживаются сильнее. Элюирующая способность подвижной фазы возрастает с увеличением полярности.

Ионообменная и ионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионообменными группами сорбента. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионообменными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами: -NH 3 + , -R 3 N + , -R 2 HN + , -RH 2 N + и др. используются для разделения анионов (аниониты), а сорбенты с группами: -SО 3 – , -RSО 3 – , –СООН, -PО 3 – и др. для разделения катионов (катиониты).

В качестве подвижной фазы в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используют буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография – вариант ионообменной хроматографии, в котором для детектирования определяемых соединений (ионов) используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор подвижной фазы фоновая электропроводность подвижной фазы должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них — двухколоночная ионная хроматография, основан на подавлении электропроводности электролита подвижной фазы с помощью второй ионообменной колонки или специальной мембранной системы подавления, находящейся между аналитической колонкой и детектором. При прохождении через систему электропроводность подвижной фазы снижается.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется подвижная фаза с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты: бензойную, салициловую или изофталевую.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы с размерами, превышающими максимальный диаметр пор, вообще не удерживаются и элюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими чем минимальный диаметр пор сорбента, свободно проникают в поры и элюируются из колонки последними. Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются на фракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. В результате вещества элюируются с различными временами удерживания.

Ионоэксклюзионная хроматография

В основе механима ионоэксклюзионной хроматографии лежит эффект, в результате которого соединения в ионизированной форме не удерживаются на сорбенте-ионообменнике, тогда как соединения в молекулярной форме распределяются между неподвижной и водной фазами внутри пор ионообменного сорбента и подвижной фазой мигрирующее в пространстве между частицами сорбента. Разделение основано на электростатическом отталкивании, полярных и гидрофобных взаимодействиях между растворенными соединениями и сорбентом.

Анионогенные группы на поверхности сорбента действуют как полупроницаемая «мембрана» между стационарной и подвижной фазами. Отрицательно заряженные компоненты не достигают стационарной подвижной фазы, так как отталкиваются одноименно заряженными функциональными группами и элюируются в «мертвом» (свободном) объеме колонки. Компоненты в молекулярном виде не «отторгаются» катионообменным сорбентом и распределяются между стационарной и подвижной фазами. Различие в степени удерживания неионных компонентов смеси продиктовано совокупностью полярных взаимодействий неионных компонентов с функциональными группами катионообменного сорбента и гидрофобных взаимодействий неионных компонентов с неполярной матрицей сорбента.

Хиральная хроматография

Целью хиральной хроматографии является разделение оптических изомеров. Разделение осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на обычных ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз. В качестве хиральных неподвижных фаз используются сорбенты с поверхностью модифицированной, группами или веществами, имеющими хиральные центры (хитозаны, циклодекстрины, полисахариды, белки и др. (хиральные селекторы). В качестве подвижных фаз в этом случае могут использоваться те же фазы, что и в нормально-фазовой или обращенно-фазовой хроматографии. При использовании ахиральных неподвижных фаз для обеспечения разделения энантиомеров в подвижные фазы добавлятся хиральные модификаторы: хиральные комплексы металлов, нейтральные хиральные лиганды, хиральные ион-парные реагенты и др.

Ультраэффективная жидкостная хроматография

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективностью по сравнению с классической высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии является использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хроматографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1 до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл. Использование таких хроматографических колонок позволяет значительно уменьшить время анализа и повысить эффективность хроматографического разделения. Однако, при этом давление на колонке может достигать 80 – 120 МПа, требуемая частота сбора данных детектора может возрастать до 40-100 герц, внеколоночный объем хроматографической системы должен быть минимизирован. Хроматографическое оборудование и колонки, используемые в ультраэффективной жидкостной хроматографии специально адаптированы для выполнения требований этого вида хроматографии.

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии.

(ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жид-

кость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную непод-

вижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда назы-

вают «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следую-

щие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную,

эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с по-

верхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной

(как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и

подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и об-

ращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором ис-

пользуются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с при-

витыми NH2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с раз-

личными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии ис-

пользуют неполярные химически модифицированные сорбенты (например,

неполярный алкильный радикал C18 ) и полярные подвижные фазы (например,

метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоции-

ровавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через

сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионны-

ми группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной)

хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из ко-

лонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы,

а последними выходят вещества с малыми размерами м олекул.

Часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механи змам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых нега-

зообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основ-

ные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емко-

сти с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фа-

зы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняю-

щимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим,

а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают

фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Совре-

менная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять со-

став ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Сме-

шение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком дав-

лении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании,

однако более точное соотношение компонентов достигается при предвари-

тельном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превы-

шало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демп-

ферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали на-

сосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Смесители

По своей конструкции смесители могут быть статическими или дина-

мическими.

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из от-

дельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешивание растворителей обычно происходит самопроизвольно, но иногда применяются системы с принудительным сме-

шиванием.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными для ввода проб от

1 мкл до 2 мл или дискретными для ввода пробы только определенного объ-

ема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен не-

посредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока ПФ и осуществлять предварительное введение пробы в петлю определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл).

Этот объем указан на маркировке петли. Конструкция инжектора позволяет осуществлять замену петли. Для введения анализируемого раствора в неав-

томатический инжектор используется ручной микрошприц с объемом, значи-

тельно превосходящим объем петли. Избыток введенного раствора, не по-

местившийся в петле, сбрасывается, и в колонку вводится точный и всегда одинаковый объем пробы. Ручное неполное заполнение петли снижает точ-

ность и воспроизводимость дозирования и, следовательно, ухудшает точ-

ность и воспроизводимость хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закры-

тые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитиче-

ской колонки в зависимости от механизма хроматографического разделения может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более (обычно она составляет

10–25 см), внутренний диаметр – от 2 до 10 мм (обычно 4,6 мм). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хрома-

тографии. Используются также капиллярные колонки с внутренним диамет-

ром около 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии имеют внутренний диаметр до 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие ко-

лонки (предколонки) выполняющие различные вспомогательные функции

(чаще – защита аналитической колонки). Обычно анализ проводят при ком-

натной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и со-

кращения продолжительности анализа может быть использовано термоста-

тирование колонок при температурах не выше 60 С. При более высоких температурах возможна деструкция сорбента и изменение состава ПФ.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нор-

мально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном слу-

чае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фа-

зами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвиж-

ной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например произ-

водные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины,

используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматогра-

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень хими-

ческой модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или не-

правильную форму и разнообразную пористость.

В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октильные группы (сорбент октилсилан или С8 );

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан

(ODS) или С18 );

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH2 );

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в

обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С18 .

В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-

фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH2 », «диол») в сочетании с неполярными раствори-

Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем.

Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более.

Используются также монолитные сорбенты.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопи-

ческих размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колон-

ки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция,

показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физиче-

ского или физико-химического параметра ПФ от времени.

Наиболее распространенными являются спектрофотометрические де-

текторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптиче-

ской плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрас-

ной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом слу-

чае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.

Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позво-

ляет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапа-

зоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие прово-

дить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.

С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгно-

венно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых ком-

понентов.

Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Совре-

менные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хромато-

граммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анали-

зируемых соединений.

Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы

(рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).

Используются также электрохимические детекторы (кондуктометриче-

ские, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-

детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые дру-

Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие уг-

леводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные

растворители с небольшими добавками полярных органических соединений,

которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные ор-

ганические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для опти-

мизации разделения часто используют водные растворы с определенным зна-

чением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неоргани-

ческих и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (на-

пример, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахираль-

ном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необхо-

димости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться мас-

совое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при опреде-

ленной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указыва-

ется на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущен-

ные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворивших-

ся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях,

водные растворы, предварительно смешанные с водой органические раство-

рители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование

под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопря-

женный с хроматографом персональный компьютер с установленным про-

граммным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хро-

матограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основны-

ми параметрами хроматографической системы.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры ко-

лонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), со-

став ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и усл овия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.

ИОНООБМЕННАЯ И ИОННАЯ ВЭЖХ

Ионообменная хроматография используется для анализа как органиче-

ских (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неор-

ганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компо-

нентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными груп-

пами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиони-

ты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионо-

обменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с приви-

тыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами -(СН2 )3 N+ Х– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами -(СН2 )SО3 – Н+ – для разделения катионов.

Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разд е-

ления катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные рас-

творы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органиче-

ских растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография - вариант ионообменной хроматографии, в

котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества ис-

пользуется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного оп-

ределения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электроли-

та ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между ана-

литической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализа-

ция ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деиони-

зированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами,

обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки вре-

мени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действую-

щим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно об-

новляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении,

противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хро-

матография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропро-

водностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органиче-

ские кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение

молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах мо-

лекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют по-

ристые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды.

Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.

Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбен-

ты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидро-

фобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и

гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметр а пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фа-

зой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сор-

бента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между са-

мыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся ак-

тов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.

В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания ис-

пользуется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.

Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзион-

ная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-

проникающую хроматографию.

Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделе-

ния водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.

В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сор-

бенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тет-

рагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малораство-

римых в воде.

Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра).

Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы.

Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрацион-

ным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу по-

лимера в ПФ.

УЛЬТРАЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективно-

стью по сравнению с классической ВЭЖХ.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии являет-

ся использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хро-

матографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1

до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл.

Хроматографическое оборудование, используемое в классическом ва-

рианте ВЭЖХ, обычно специально адаптировано для этого вида хроматогра-

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте ВЭЖХ.

Жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит в результате различия их в сорбируемости на данном адсорбенте (в соответствии с законом адсорбционного замещения, установленного М. С. Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно развитой внутренней поверхностью, удерживающие жидкости с помощью межмолекулярных и поверхностных явлений. Это могут быть полярные и неполярные неорганические и органические соединения. К полярным адсорбентам относятся силикагель (высушенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алюминия, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Неполярные сорбенты - активированный уголь, порошок резины и множество других, полученных синтетическим путем.

К адсорбентам предъявляют следующие требования: S они не должны вступать в химические реакции с подвижной фазой и разделяемыми веществами; S должны обладать механической прочностью; S зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процесса учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых веществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку диаметром 0,5 - 5 см и длиной 20 - 100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздействием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имеющимся внизу колонки краном. Анализируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрации определяемых веществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоящее время применяется, главным образом не как самостоятельный метод анализа, а как способ предварительного (иногда и конечного) разделения сложных смесей на более простые, т.е. для подготовки к анализу другими методами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токоферолов, пропускают элюент и собирают фракцию а-токоферола для последующего определения фотометрическим методом.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая об-ращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (Оф ВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбенгов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3,4 (рис. 7.1.1.1), управляемых микропроцессором 5, и подающих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически отбираются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2 - 6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хро-матограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хромато-грамме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания tR и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно (рис.7.1.1.2), где t.R(A) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика, 1К(вс) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), аш - ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента IR* с временем удерживания IRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(Bc), затем хроматографиче-ски разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удерживания определяют по формуле (7.1.1.1).

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (ai/2), измеренную на половине его высоты (рис.7.2.3); планиметрированием; с помощью интегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градировочного графика рассчитывают его количество.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют-транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.